【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种α-淀粉酶及其制备方法，尤其涉及一种α-淀粉酶突变体及其基因、载体和制备方法。
技术介绍
1、淀粉酶是一种水解酶，可以水解淀粉分子中存在的糖苷键并产生糊精和寡糖。淀粉酶主要分为三种亚型，即α、β和γ型，其中α-淀粉酶是研究最深入、用途最广泛的淀粉水解酶。α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶，ec 3.2.1.1)可以切割淀粉分子中葡萄糖残基与其他类似α-葡聚糖之间存在的α-1,4-d-葡萄糖苷键，从而产生葡萄糖、短链寡糖、限制性糊精、麦芽三糖和麦芽糖。淀粉由两种聚合物组成，即直链淀粉(由α-1,4-d-葡萄糖苷键连接)和支链淀粉(由α-1,4-d-葡萄糖苷键和α-1,6-d-葡萄糖苷键连接)，其水溶液往往呈现较高的粘稠度。而α-淀粉酶可以降低淀粉水溶液的粘稠度，因此也被称为液化型淀粉酶。
2、α-淀粉酶主要来自于微生物的表达，包括细菌和真菌。微生物来源的α-淀粉酶生产成本更低、易于在基因水平和蛋白质水平上进行人工编辑、具有高稳定性和特异性，广泛应用于食品、制药和化学工业。例如在制糖业中用以淀粉糊化和生产糖浆、纺织工业中用于纸张退浆、将农业废料生产为动物饲料或生物燃料、制药和化学行业中用于分析检测、城市污水净化等。目前，α-淀粉酶的研究方向不仅在于其生产，还在于人工改造野生型α-淀粉酶以提高其稳定性，使其适合在极端条件下应用。
3、现有的微生物衍生的α-淀粉酶主要来自解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其产生的α-淀粉酶最适为ph 5.0-6.0，最适温度在35-80℃之间。当酶溶液
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种热稳定性和ph稳定性均较高的α-淀粉酶突变体。本专利技术的第二目的是提供一种能够表达α-淀粉酶突变体的重组基因。本专利技术的第三目的是提供一种能够扩增或表达突变体基因的载体。本专利技术的第四目的在于提出一种α-淀粉酶突变体的制备方法，解决如何点突变改造野生型α-淀粉酶的问题。
2、技术方案：本专利技术所述的一种α-淀粉酶突变体，包括如下点突变：将seq id no.1所示氨基酸序列第261位脯氨酸突变为甘氨酸或组氨酸和将第262位亮氨酸突变为异亮氨酸或精氨酸。
3、本专利技术对来自cordyceps farinosa的α-淀粉酶序列进行人工优化，在原始α-淀粉酶中相邻的β折叠结构之间、空间位置相近的氨基酸进行定点饱和突变，增加其相互作用力，以提高酶突变体的稳定性。
4、本专利技术是在原始α-淀粉酶序列的基础上，进行一种或多种氨基酸的置换突变。其中原始α-淀粉酶来源于真菌cordyceps farinosa的基因组，突变方式包括：第63位亮氨酸突变为异亮氨酸、第63位亮氨酸突变为色氨酸、第63位亮氨酸突变为缬氨酸、第63位亮氨酸突变为组氨酸、第115位亮氨酸突变为谷氨酰胺、第115位亮氨酸突变为蛋氨酸、第115位亮氨酸突变为精氨酸、第115位亮氨酸突变为天冬酰胺、第261位脯氨酸突变为甘氨酸、第261位脯氨酸突变为组氨酸、第262位亮氨酸突变为异亮氨酸、第262位亮氨酸突变为精氨酸、第266位酪氨酸突变为天冬氨酸、第266位酪氨酸突变为蛋氨酸、第266位酪氨酸突变为亮氨酸、第316位天冬酰胺突变为精氨酸、第316位天冬酰胺突变为蛋氨酸、第316位天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第316位天冬酰胺突变为缬氨酸、第316位天冬酰胺突变为异亮氨酸、第317位丙氨酸突变为半胱氨酸、第317位丙氨酸突变为丝氨酸、第317位丙氨酸突变为亮氨酸、第317位丙氨酸突变为色氨酸、第317位丙氨酸突变为异亮氨酸。
5、进一步地，在上述第261位和第262位点突变的基础上，点突变还包括将seq idno.1所示氨基酸序列第316位天冬氨酸突变为精氨酸或蛋氨酸或苯丙氨酸；和将第317位丙氨酸突变为丝氨酸或色氨酸或亮氨酸。
6、进一步地，在上述第261位、第262位点、第316位和第317位点突变的基础上，所述点突变还包括将seq id no.1所示氨基酸序列第266位酪氨酸突变为亮氨酸或天冬氨酸。
7、进一步地，在上述第261位和第262位点突变的基础上，所述点突变还包括将seqid no.1所示氨基酸序列第63位亮氨酸突变为异亮氨酸或色氨酸。
8、进一步地，在上述第261位、第262位和第63位点突变的基础上，所述点突变还包括将seq id no.1所示氨基酸序列第115位亮氨酸突变为精氨酸。
9、优选地，所述α-淀粉酶突变体的氨基酸序列具体为seq id no.2-7所示序列中的一种，分别为：
10、将原始酶序列中第261位脯氨酸、262位亮氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸；
11、将原始酶序列中第63位亮氨酸、261位脯氨酸、262位亮氨酸突变为异亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸；
12、将原始酶序列中第63位亮氨酸、115位亮氨酸、261位脯氨酸、262位亮氨酸突变为色氨酸、精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸；
13、将原始酶序列中第261位脯氨酸、262位亮氨酸、266位酪氨酸、316位天冬氨酸、317位丙氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸。
14、将原始酶序列中第261位脯氨酸、262位亮氨酸、316位天冬氨酸、317位丙氨酸突变为组氨酸、精氨酸、精氨酸、丝氨酸。
15、将原始酶序列中第261位脯氨酸、262位亮氨酸、266位酪氨酸、316位天冬氨酸、317位丙氨酸突变为组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。
16、为了重组表达上述α-淀粉酶突变体，本专利技术提供一种编码上述α-淀粉酶突变体蛋白的基因。
17、基于上述α-淀粉酶突变体蛋白的基因序列，本专利技术构建了含有上述基因的克隆载体或表达载体。载体可以为质粒或病毒。
18、为了制备上述α-淀粉酶突变体，本专利技术提供一种α-淀粉酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
19、(1)设计点突变引物，以原始c.farinoseα-淀粉酶基因为模板，采用点突变引物进行pcr反应得到突变基因；
20、(2)将突变基因插入表达载体后转入宿主菌进行发酵表达；
21、(3)收集表达α-淀粉酶突变体的宿主菌，重悬菌体后破碎细胞，离心取上清即得含有α-淀粉酶突变体的粗酶液。
22、优选地，所述点突变引物的序列包括：
23、
24、
25、注：引物中下划线标记的为突变位点
26、所述pcr反应的体系为：
27、
28、pcr反应的条件为：
29、
30、退火温度可以在56-58本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种α-淀粉酶突变体，其特征在于，包括如下点突变：将SEQ ID No.1所示氨基酸序列第261位脯氨酸突变为甘氨酸或组氨酸和将第262位亮氨酸突变为异亮氨酸或精氨酸。
2.根据权利要求1所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述点突变还包括将SEQ IDNo.1所示氨基酸序列第316位天冬氨酸突变为精氨酸或蛋氨酸或苯丙氨酸；和将第317位丙氨酸突变为丝氨酸或色氨酸或亮氨酸。
3.根据权利要求2所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述点突变还包括将SEQ IDNo.1所示氨基酸序列第266位酪氨酸突变为亮氨酸或天冬氨酸。
4.根据权利要求1所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述点突变还包括将SEQ IDNo.1所示氨基酸序列第63位亮氨酸突变为异亮氨酸或色氨酸。
5.根据权利要求4所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述点突变还包括将SEQ IDNo.1所示氨基酸序列第115位亮氨酸突变为精氨酸。
6.根据权利要求1所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，α-淀粉酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2-7所示序列中的一种。<...
【技术特征摘要】
1.一种α-淀粉酶突变体，其特征在于，包括如下点突变：将seq id no.1所示氨基酸序列第261位脯氨酸突变为甘氨酸或组氨酸和将第262位亮氨酸突变为异亮氨酸或精氨酸。
2.根据权利要求1所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述点突变还包括将seq idno.1所示氨基酸序列第316位天冬氨酸突变为精氨酸或蛋氨酸或苯丙氨酸；和将第317位丙氨酸突变为丝氨酸或色氨酸或亮氨酸。
3.根据权利要求2所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述点突变还包括将seq idno.1所示氨基酸序列第266位酪氨酸突变为亮氨酸或天冬氨酸。
4.根据权利要求1所述α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述点突变还包括将seq idno.1所示氨基酸序列第6...
【专利技术属性】
技术研发人员：任鑫坤，余克洋，王骞，曹家南，范鑫龙，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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