一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列制造技术

本发明专利技术公开了一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，编码三磷酸腺苷隧道金属酶的基因为ZjAC2，ZjAC2具有如序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。本发明专利技术采用上述的一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，编码的蛋白除腺苷酸环化酶活性外，还具备NTP水解酶活性、三聚磷酸酶活性以及较弱的焦磷酸酶活性。较弱的焦磷酸酶活性。较弱的焦磷酸酶活性。

【技术实现步骤摘要】
一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列


[0001]本专利技术涉及三磷酸腺苷隧道金属酶
，尤其是涉及一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列。

技术介绍

[0002]三磷酸腺苷隧道金属酶(Triphosphate tunnel metalloenzymes，TTMs)超家族是由一组具有水解多种三聚磷酸盐能力的蛋白组成，在生物中普遍存在。该蛋白超家族的催化特征为：底物均为三磷酸底物，需要二价金属辅离子才能发挥酶活性。并且，该蛋白超家族的结构相似，所有的TTM蛋白都有8条反向平行的β折叠链和一个EXEXK基序。
[0003]在拟南芥中发现了3个AtTTMs基因，其中AtTTM1、2编码的蛋白表现出焦磷酸酶活性和较弱的ATP水解酶活性，而AtTTM3编码的蛋白表现出三聚磷酸酶活性，三个蛋白均无腺苷酸环化酶(AC)活性。
[0004]随着测序技术的发展，研究发现了更多的TTMs基因，但是目前获得的信息还远远不足以充分认识TTM蛋白的特征，因此需要更多的研究和数据对其进行鉴定。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，编码的蛋白除腺苷酸环化酶活性外，还具备NTP水解酶活性、三聚磷酸酶活性以及较弱的焦磷酸酶活性。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，编码三磷酸腺苷隧道金属酶的基因为ZjAC2，ZjAC2具有如序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。
[0007]优选的，ZjAC2的核心区序列是由以下核苷酸序列为引物扩增获得：
[0008]正向：5
’‑
ATGGAGGTCGAAGTCAAGCT
‑3’
；
[0009]反向：5
’‑
CTAAGGCAGCTTTCCGGATC
‑3’
。
[0010]一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列的衍生序列，该衍生序列为所述的ZjAC2基因序列的一个或几个碱基的置换、插入或缺失获得的该基因序列的变构体。
[0011]因此，本专利技术采用上述一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，编码的蛋白除腺苷酸环化酶活性外，还具备NTP水解酶活性、三聚磷酸酶活性以及较弱的焦磷酸酶活性。
[0012]下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0013]图1是大肠杆菌cyaA缺陷型互补试验培养皿示意图；
[0014]图2是蛋白质体外催化试验中腺苷酸环化酶活性柱状图；
[0015]图3是水解酶活性试验柱状图；
[0016]图4是Mn
2+
、Mg
2+
、Ca
2+
条件下，焦磷酸酶加入前后ATP水解酶活性变化柱状图；
[0017]图5是枣在体基因瞬时表达试验中ZjAC2基因的表达量及cAMP的含量随时间变化折线图。
具体实施方式
[0018]以下通过附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0019]实施例一
[0020]ZjAC2基因的扩增
[0021]提取冬枣果实RNA，后反转录为cDNA作PCR扩增模板，进行PCR扩增；其中，正向引物：5
’‑
ATGGAGGTCGAAGTCAAGCT
‑3’
，反向引物：5
’‑
CTAAGGCAGCTTTCCGGATC
‑3’
。
[0022]PCR扩增程序：94℃，4min；(94℃，40s；56℃，45s；72℃，50s)35个循环；72℃，10min。
[0023]PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，并对候选目的条带进行琼脂糖凝胶回收，回收产物连接入pMDTM19
‑
T克隆载体进行测序，得到ZjAC2序列，作为候选枣腺苷酸环化酶基因，进行功能验证。
[0024]实施例二
[0025]大肠杆菌缺陷型互补试验
[0026]培养大肠杆菌cyaA缺陷型菌株SP850，SP850菌株缺少腺苷酸环化酶(AC)基因，将带有ZjAC2基因的pET
‑
15b重组质粒分别热激转化入SP850后，涂布与氨苄和卡纳抗生素培养皿，挑单克隆培养至OD600为0.5，后诱导表达培养4h，于麦康凯培养基划线培养，观察。
[0027]结果发现，如图1，带有重组质粒的SP850缺陷型菌株和野生型大肠杆菌菌株的菌落颜色均为红色，而SP850缺陷型菌株在麦康凯培养基中显色为白色，说明ZjAC2基因弥补了SP850菌株中缺少的cyaA基因，发挥了腺苷酸环化酶基因的功能。
[0028]实施例三
[0029]蛋白质体外催化试验
[0030]将带有ZjAC2基因的pET
‑
15b重组载体转入大肠杆菌BL21菌株，37℃，200rpm培养，IPTG诱导蛋白表达后，后进行蛋白提取纯化，所得蛋白用于酶催化活性检测，结果如图2
‑
4。结果发现，Mn
2+
和Ca
2+
作为辅酶离子时，催化体系中产生了cAMP，说明ZjAC2蛋白能够催化ATP形成cAMP，发挥了AC的功能；此外，在Mg
2+
作辅酶离子时，反应产物中还存在大量Pi，而加入焦磷酸水解酶后，Pi含量没有增多，说明ZjAC2蛋白将ATP水解为ADP和PPi，而Mn
2+
和Ca
2+
作为辅酶离子时，反应产物中Pi含量较少，而在加入焦磷酸酶后，Pi含量激增，说明了在这两种离子环境下，ZjAC2蛋白将ATP水解为了AMP和PPi。
[0031]AC酶活性检测方法：
[0032]催化体系：50mM TRIS
‑
HCl(pH 7.5)，0.5mM ATP和20mM辅酶金属离子，催化条件为30℃，20min。催化完成后使用高效液相色谱(HPLC)，检测催化体系中cAMP含量，从而确定酶催化活性及效率。
[0033]检测参数如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB
‑
C18(4.6
×
250mm,5μm)，柱温30℃，流动相为甲醇：20mmoL磷酸二氢钾体积比10：90，检测波长254nm，进样体积20μm，流速
0.8mL/min。
[0034]磷酸水解酶活性检测方法：
[0035]使用Sigma公司单磷检测试剂盒(Malachite Green Phosphate Assay Kit(POMG
‑
25H))进行第一次单磷含量检测，之后在反应体系中加入焦磷酸酶继续反应20min，后再次检测反应体系中单磷含量，以此来确定水解酶活性的产物为ADP或AMP。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，其特征在于：编码三磷酸腺苷隧道金属酶的基因为ZjAC2，ZjAC2具有如序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。2.根据权利要求1所述的一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，其特征在于，ZjAC2的核心区序列是由以下核苷酸序列为引物扩增获得：正向：5
’‑
ATGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘孟军，刘志国，袁野，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：