表观遗传分析方法技术

用于分析DNA的方法包括通过以下形成经标记的DNA片段：将基因组DNA切割成DNA片段，用包含可水解部分的接头选择性地使DNA中存在的任何未甲基化CpG位点官能化，以及将标记连接至所述接头。所述方法还包括：将经标记的DNA片段与任何未经标记的DNA片段分离，使所分离的经标记DNA片段中接头的可水解部分水解以便从所述标记中释放DNA片段，以及对所释放的DNA片段进行测序。进行测序。进行测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表观遗传分析方法
[0001]本专利技术涉及用于表观遗传分析的方法。更具体地，本专利技术涉及用于表观遗传分析的方法，其包括用包含可水解部分的接头选择性地使DNA的未甲基化CpG位点官能化。
[0002]表观遗传学是不涉及DNA序列改变的基因组可遗传修饰的研究。这样的修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA相关基因沉默。表观遗传修饰在细胞内发挥至关重要的作用，最主要在真核生物基因表达的调控中发挥至关重要的作用。
[0003]DNA甲基化通过向DNA添加甲基(CH3)基团而发生。最广泛表征的DNA甲基化过程是将甲基添加至胞嘧啶环的5
‑
碳上，产生5
‑
甲基胞嘧啶(5mC)。在体细胞中，5
‑
甲基胞嘧啶主要局限于CpG(胞嘧啶
‑
磷酸
‑
鸟嘌呤)位点(也称为“CG”位点)。当基因启动子区域中的CpG位点被甲基化时，基因的表达被抑制。向DNA添加甲基基团是通过称为DNA甲基转移酶的酶进行的。
[0004]表观遗传修饰的组织的变化与越来越多的疾病有关。近年来，对研究表观遗传修饰在多种疾病(包括癌症和心脏病)中以及在衰老和人发育的机制中的作用的研究工作相当感兴趣。
[0005]有许多方法可用于研究表观基因组。然而，目前的一些方法具有覆盖不均匀、缺乏特异性、对DNA的苛刻化学处理和/或高成本的问题。
[0006]考虑到这些问题而设计了本专利技术。
[0007]根据本专利技术的第一方面，提供了用于分析DNA，例如用于表观遗传分析的方法，该方法包括：
[0008]‑
通过以下形成经标记的DNA片段：
[0009](a)将基因组DNA切割成DNA片段；
[0010](b)用包含可水解部分的接头选择性地使DNA中存在的任何未甲基化CpG位点官能化；以及
[0011](c)将标记连接至接头；
[0012]‑
将经标记的DNA片段与任何未经标记的DNA片段分离；
[0013]‑
使所分离的经标记DNA片段中接头的可水解部分水解，以便从标记中释放DNA片段；
[0014]以及
[0015]‑
对所释放的DNA片段进行测序。
[0016]应当理解，上述步骤(a)、(b)和(c)可以以任何顺序进行。例如，可以在用接头使DNA官能化之前将标记连接至接头。可以在切割DNA之前或在切割DNA之后用接头(标记可以已经或可以尚未连接至接头)使DNA官能化。因此，应当理解步骤(b)可以在基因组DNA上或在DNA片段上进行。
[0017]在一些实施方案中，步骤(c)在步骤(b)之前进行。在一些实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之后或在步骤(c)之后进行。在一些实施方案中，该方法以所述顺序进行，即以步骤(a)、随后是步骤(b)、随后是步骤(c)的顺序进行。
[0018]在一些实施方案中，形成经标记DNA片段的步骤通过按所述顺序执行步骤(a)、(b)
和(c)来进行。因此，在一些实施方案中，本专利技术的方法包括：
[0019]‑
将基因组DNA切割成DNA片段；
[0020]‑
用包含可水解部分的接头选择性地使DNA片段中存在的任何未甲基化CpG位点官能化，从而形成官能化的DNA片段；
[0021]‑
将标记连接至官能化的DNA片段的接头，从而形成经标记的DNA片段；
[0022]‑
将经标记的DNA片段与任何未经标记的DNA片段分离；
[0023]‑
使所分离的经标记DNA片段中接头的可水解部分水解，以便从标记中释放DNA片段；以及
[0024]‑
对所释放的DNA片段进行测序。
[0025]基因组DNA可以存在于样品中。样品可以已经从动物例如人中获得。样品还可包含合适的稀释剂或缓冲剂。
[0026]基因组DNA的切割可以酶促地进行，例如使用限制酶。或者，可以使用机械技术(例如超声或剪切)将基因组DNA切割成片段。在一些实施方案中，使用产生黏性末端(即，在所得DNA片段末端的未配对核苷酸的突出端或延伸(stretch))的限制酶进行切割。或者，可以使用限制酶，其产生具有平末端的DNA片段(其中所得DNA片段的两条链都以碱基对终止)。可以使用对CpG甲基化不敏感的任何限制酶。导致黏性末端且对CpG甲基化不敏感的合适限制酶的一个实例是SaqAI，其在识别位点T^TAA处切割DNA。
[0027]任选地，该方法还包括在切割之前分离基因组DNA的步骤。基因组DNA可以从已经培养的细胞中分离。从细胞中分离基因组DNA的方案是本领域技术人员已知的。可以使用市售的试剂盒(例如如由Qiagen出售的)根据制造商的说明进行基因组DNA的分离。
[0028]在一些实施方案中，可水解部分包含席夫碱。在一些实施方案中，席夫碱是N
‑
取代的腙或O
‑
取代的肟。
[0029]在一些实施方案中，可水解部分包含二硫(S
‑
S)键。
[0030]接头可具有以下通式：
[0031][0032]其中FG表示包含反应性中心的官能团；
[0033]Z表示选自脂族键或芳族键之一的非反应性基团；
[0034]A
‑
B
‑
C表示可水解部分(例如席夫碱部分)；
[0035]Y表示选自脂族键或芳族键的非反应性基团；并且
[0036]U表示不饱和键，其选自以下中的一者：烯烃、炔烃、芳基、羰基或包含一个或两个S＝O键的基团。
[0037]在一些实施方案中，可水解部分包含以下结构之一：
[0038][0039]其中R
x
表示氢原子、氘原子、芳族基团或脂族基团之一。
[0040]选择性地使存在于DNA中的任何未甲基化CpG位点官能化的步骤可包括在未甲基化CpG位点与接头官能团的反应性中心之间形成共价键。
[0041]在一些实施方案中，在DNA与反应性中心之间形成的共价键可以是例如碳
‑
碳键、碳
‑
氮键、碳
‑
硫键或碳
‑
氧键。在一些实施方案中，共价键是碳
‑
碳键。
[0042]共价键可以在反应性中心与未甲基化CpG位点的胞嘧啶环的5位之间形成。
[0043]甲基转移酶(Methyltransferase，MTase)正在成为DNA、RNA和蛋白质的位点选择性修饰的重要工具。实际上，甲基转移酶催化甲基从S
‑
腺苷
‑
L
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甲硫氨酸辅因子至DNA或RNA的高度特异性转移。将甲基引入至这些类别的生物分子有助于调节细胞内的基因表达水平。
[0044]在mTAG标记中，使用S
‑
腺苷
‑
L
‑
甲硫氨酸辅因子类似本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于分析DNA的方法，所述方法包括：
‑
通过以下形成经标记的DNA片段：(a)将基因组DNA切割成DNA片段；(b)用包含可水解部分的接头选择性地使所述DNA中存在的任何未甲基化CpG位点官能化；以及(c)将标记连接至所述接头；
‑
将所述经标记的DNA片段与任何未经标记的DNA片段分离；
‑
使所分离的经标记DNA片段中接头的可水解部分水解，以便从所述标记中释放所述DNA片段；以及
‑
对所释放的DNA片段进行测序。2.权利要求1所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之前进行。3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)在步骤(b)之后或在步骤(c)之后进行。4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中用接头选择性地使所述DNA中的任何未甲基化CpG位点官能化是使用DNA甲基转移酶进行的，所述DNA甲基转移酶能够选择性地将可转移基团从S
‑
腺苷
‑
L
‑
甲硫氨酸辅因子类似物转移至所述DNA的未甲基化CpG位点，其中所述可转移基团构成所述接头。5.权利要求4所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶是胞嘧啶
‑
5甲基转移酶，任选地其中所述胞嘧啶
‑
5甲基转移酶是M.MpeI。6.权利要求5所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶是M.MpeI的双突变体(Q136A/N374A)。7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可水解部分包含亚胺部分(例如，席夫碱部分)、肟部分或腙部分。8.权利要求7所述的方法，其中所述可水解部分包含席夫碱。9.权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述S
‑
腺苷
‑
L
‑
甲硫氨酸类似物具有以下通式：其中R表示可转移基团，其构成所述接头；FG表示官能团；Z表示选自脂族键或芳族键之一的非反应性基团；A
‑
B
‑
C表示所述可水解部分；Y表示选自脂族键或芳族键之一的非反应性基团；
U表示不饱和键，其例如选自以下中的一者：烯烃、炔烃、芳基、包含羰基的碳原子、包含一个或两个S＝O键的硫原子；并且k表示1或2的整数。10.权利要求9所述的方法，其中Z包含聚醚链，任选地包含含有最多5个乙二醇单体的聚乙二醇链。11.权利要求9或权利要求10所述的方法，其中FG选自叠氮化物、炔烃、异硫氰酸酯/盐或异氰酸酯/盐部分之一。12.权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述S
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腺苷
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L...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特，
申请(专利权)人：伯明翰大学，
类型：发明
国别省市：