一种非诊断目的的基因定位方法技术

本发明专利技术公开了一种非诊断目的的基因定位方法，适用于不同形态的DNA，所述不同形态的DNA包括环形单链DNA和线性双链DNA，具体操作步骤包括：首先通过PCR将环形单链的DNA变成双链DNA以及将线性双链的DNA变成合适长度的双链DNA，加入限制性核酸内切酶消化后得到具有“缺口”的DNA链，再加入三嵌段引物与DNA连接酶，从而得到所需模板，最后加入DNA折纸探针，利用PCR退火使得模板捕获到游离的DNA折纸探针，经过原子力显微镜表征达到可视化的基因定位。本发明专利技术的基因定位的方法可以对6

【技术实现步骤摘要】
一种非诊断目的的基因定位方法


[0001]本专利技术属于检测分析及生物学应用领域，具体涉及一种非诊断目的的基因定位方法。

技术介绍

[0002]在遗传学上，遗传标记手段主要包括根据物种形态性状的区别进行形态标记和利用同工酶进行生化标记，其本质都是针对染色体上的基因进行定位，基因定位（Gene mapping）是基因组测序、病原菌鉴定等领域中的重要手段，具体是指基因所属连锁群或染色体以及基因在染色体上的位置的测定，基因定位是遗传学研究中的一项基本工作，其目的不仅在定位染色体上的基因片段，而且还在于测定基因在染色体上线性排列的顺序和距离。
[0003]基于以上标记手段得到的结果都间接反映在表现型的差异，近几十年中，现代分子生物学技术蓬勃发展，一种新兴的遗传标记技术正日渐成熟，那就是 DNA 分子标记。DNA 分子标记是一种根据基因片段碱基序列的差异直接反映个体间差异的遗传标记手段，与传统遗传标记手段相比，具有以下优势：（1）跨越表型特征，直接体现遗传物质上的变异；（2）可标记的基因位点极多，核酸序列差异明显；（3）对遗传性状的选择不受影响。
[0004]因此，在DNA纳米
，定位DNA链上具有相同序列的基因片段，实则是一种DNA分子标记过程。利用荧光分子实现DNA分子标记是基于DNA纳米技术的一种应用技术。目前，现有技术中主要是利用核酸内切酶作用于单分子DNA，再通过 DNA 聚合酶发挥作用并携带荧光分子标记在特定位点并在全内置反射荧光显微镜下观察，或采用DNA 折纸探针的特异性标记并且在原子力显微镜下直接可视化观察，用不同的限制酶处理同一DNA分子，通过对酶切产生的DNA片段的大小和位置的分析，可以绘制出某一DNA分子的限制图谱。
[0005]但是，目前上述物理图谱法必须在严格控制的变性条件下每一种DNA分子具有变性环的特定分布形式，才能构成部分变性图，从而对基因组的序列进行检测，因此现有的基因定位方式存在定位的时间较长、费用昂贵、操作复杂等问题。

技术实现思路

[0006]为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种非诊断目的的基因定位方法，可适用于不同形态DNA上的基因定位，且解决现有基因定位存在的成本高、耗时长、精确度低的问题。
[0007]一种非诊断目的的基因定位方法，包括以下步骤，其中，步骤S2和步骤S3过程如图1所示：步骤S1：设计上下游引物，加入DNA聚合酶经PCR扩增出目标序列，所述目标序列来自生物体或人工合成的双链DNA或单链DNA，目标序列不仅限于单一的生物体DNA以及同类型的DNA形态；
对于双链DNA，设计合适的上下游引物，加入DNA聚合酶经PCR扩增出所需序列；所述DNA聚合酶优选La Taq DNA聚合酶；对于环形单链DNA，在环形单链DNA中加入部分互补的DNA序列，加入DNA聚合酶，经PCR扩增成一个环形双链DNA；所述DNA聚合酶优选为Vent(exo
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) DNA聚合酶；步骤S2：步骤S1中获得的模板链中加入切刻内切酶，优选采用两种以上识别序列不同的切刻内切酶，可以在同一模板链上实现多组序列的识别和切除，从而在双链模板上形成基于切刻内切酶的“缺口”DNA，所述切刻内切酶避免了双链酶切成单链再加入引物延伸成双链不彻底的问题；步骤S3：利用DNA连接酶和引物填补“缺口”，所述引物为三嵌段引物，所述三嵌段引物为一端DNA单链，一端与“缺口”序列碱基互补、另一端用于捕获DNA折纸探针，所述DNA折纸探针为具有捕获链的DNA折纸探针；步骤S4：加入过量DNA折纸探针与标记有特定三嵌段引物的目标DNA分子经PCR退火一夜后，利用原子力显微镜对不同的DNA折纸探针的标记进行统计和评估，对标记上折纸探针的位点之间的距离进行统计分析。
[0008]需要说明的是，参见DOI：10.1134/S1068162019050017的公开文献1“Nicking Endonucleases as Unique Tools for Biotechnology and Gene Engineering”，本专利技术所述的切刻内切酶是一种新型酶，像限制性内切酶一样，切刻内切酶识别短的特定 DNA序列，并在相对于识别序列的固定位置切割DNA，然而与限制性内切酶不同，切刻内切酶只切割一条预定的脱氧核糖核酸链；需要说明的是，所述三嵌段引物如图2所示分为三个部分：M1、M2和M3段，M1段序列为与模板缺口碱基互补的碱基序列且数量优选为6个，中间M2段序列为有若干T碱基的spacer链且T碱基数量优选为5个，通过spacer链将M1和M3连接起来，M2段由于没有与之互补的序列，具有良好的柔性，可以使M3段更好的捕捉游离的DNA折纸探针；值得注意的是：M1段序列由于“缺口”DNA的碱基数很少，它的TM温度很低，所以长片段的M3序列不适用于本应用，在考虑与DNA折纸探针相结合的退火温度情况下，最终选择采用10个碱基的M3段序列，从而提高连接精度和连接效率。在三嵌段引物的5
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端磷酸化从而可以与缺口链的3
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端的羟基结合，加入过量DNA折纸探针与标记有特定三嵌段引物的目标DNA分子经PCR退火一夜后，利用原子力显微镜对三角形或十字形DNA折纸探针的标记效率进行统计和评估，对标记上折纸探针的位点之间的距离进行统计分析。
[0009]进一步的，所述步骤S2具体包括：在步骤S2扩增出的产物中加入切刻内切酶NEs，经37℃孵育6h，通过80℃ 20min灭活后，产生所需“缺口”；优选的，所述切刻内切酶可以采用Nb.BbvCI和Nb.BssSI这两种组合使用，Nb.BbvCI可以特异性识别和切割双链中一条链上的GCTGAGG序列，Nb.BssSI可以特异性识别和切割双链中一条链上的CTCGTG序列，这些“缺口”只有6
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7个碱基远远小于现有技术中使用的20个碱基的嵌段引物链，此处采用20个碱基的嵌段引物链方案参见DOI: 10.1038/ncomms14738的公开文献2“DNA origami
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based shape IDs for single
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molecule nanomechanical genotyping”，采用Nb.BbvCI和Nb.BssSI这两种切刻内切酶特异性识别和切割双链中一条链上的短序列，减少了非特异性结合，增大了基因定位的精度；由于这些识别顺序可以作为DNA部位的标记，技术人员用不同的限制酶处理同一DNA分子，通过对酶切
产生的DNA片段的大小和位置的分析，可以绘制出某DNA分子的限制图谱。但是通常选择的限制性内切酶识别的序列差异很大，从而导致了缺少切割长度差异不大的基因片段，这两种切刻内切酶，只需要引物单链，且反应时间短；进一步优选的，所述Nb.BbvCI和Nb.BssSI在NEBuffer 3.1缓冲液中使用活性最佳。
[0010]进一步的，本专利技术所述基因定位的方法，步骤S2中，采用限制性内切酶酶切双链后，加入EDTA灭活后，可利用TaKaRa MiniBES本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的基因定位方法，其特征在于，所述方法包括：通过PCR将环形单链DNA扩增成双链DNA或将线性双链的DNA扩增成合适长度的双链DNA，加入至少一种切刻内切酶消化后得到具有“缺口”的DNA链，纯化后，加入三嵌段引物与DNA连接酶，先利用PCR退火让三嵌段引物与“缺口”互补，再加入DNA连接酶使三嵌段引物3
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端的羟基与“缺口”的5
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端磷酸基团相连从而得到所需模板链；最后加入DNA折纸探针，PCR退火使模板链捕获到游离的DNA折纸探针，利用原子力显微镜观察成像实现可视化基因定位；其中，所述DNA折纸探针为具有至少一条捕获链的DNA折纸纳米结构；所述三嵌段引物包括与所述“缺口”互补的端部序列M1、若干T碱基的中间序列M2和与所述捕获链互补的端部序列M3。2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基因定位方法，其特征在于，所述将线性双链的DNA扩增成合适长度的双链DNA，具体步骤包括：设计上下游引物，线性双链的DNA中加入DNA聚合酶经PCR扩增出所需序列。3.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的基因定位方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为La Taq DNA聚合酶。4.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基因定位方法，其特征在于，所述通过PCR将环形单链DNA扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：晁洁，熊金鑫，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：