在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针，探针长度为35

【技术实现步骤摘要】
在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针及其应用


[0001]本专利技术专利涉及一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针，属于生物


技术介绍

[0002]近年来，随着高通量测序技术的快速发展，各类RNA建库技术和测序技术层出不穷并且迭代升级，大大地降低了RNA建库和测序的难度和成本，这也使得RNA高通量测序技术成为生命进展和疾病诊断等领域的重要研究手段。但是，不同来源的样本中的RNA种类占比具有极大的不均一性，如正常细胞中核糖体RNA(rRNA)约占总RNA的90％
‑
95％，血液中球蛋白的mRNA约占总mRNA的76％以上，这些RNA的存在占据了大部分的测序数据，严重影响到低丰度RNA的检测，提高了测序的成本。
[0003]现在主要有两类策略来去除这些在RNA建库过程中不需要的高丰度RNA。第一类策略为磁珠捕获法。比如polyA富集法，利用oligo(dT)磁珠来捕获富集含有polyA的mRNA，这种方法只适用于完整性较好的RNA，能够捕获的RNA种类有限，大大降低了测序的多样性，而且这种方法对polyA长度越长的RNA存在捕获效率越高，会造成RNA建库的偏好性；或者靶RNA捕获去除法，利用带有biotin修饰的反义DNA探针与靶RNA杂交后，用链亲和霉素磁珠对靶RNA进行去除。另一类种策略为核酸酶降解法。比如RNase H切割去除法，利用RNase H特异性识别并降解DNA:RNA杂交链中RNA的活性对靶RNA进行降解；或者CRISPR/Cas9切割法，利用sgRNA
‑
Cas9系统对构建好的双链DNA文库中靶RNA来源的双链DNA进行切割。这些方法存在成本高、操作复杂(约20
‑
40步)、耗时长(约2h)、对样本来源和RNA丰度要求高、试剂难以储存等缺陷，严重阻碍了RNA二代测序建库技术的工业自动化发展和其在疾病快速诊断领域的应用。
[0004]我们之前开发了一种阻碍靶RNA逆转录的快速杂交技术，原理是利用探针与靶RNA形成双链复合物，继而阻碍靶RNA的逆转录。利用这个技术，我们成功地在RNA建库过程中高效特异性地降低核糖体RNA和球蛋白RNA的测序数据占比(202110257924.X；202110553161.3)。但这种方法对逆转录酶的性能要求比较严格，对于具有高链置换能力的逆转录酶，使用该方法去除效果不佳，原因是由于高链置换能力的逆转录酶会解开杂交探针与靶RNA形成的双螺旋，导致靶RNA的逆转录阻碍效应降低。对于高GC区域的RNA(如外显子区域)，逆转录酶的链置换活性是保证这些区域有效逆转录的关键。因此，使用这种方法在RNA建库过程中去除核糖体RNA和球蛋白RNA仍存在应用局限性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针。
[0006]本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针，所述探针长度为35
‑
60nt，由前半部分的嵌合区和后半部分的配对区组成，所述嵌合区为嘧啶碱基，所述配对区与靶RNA严格互补配对，且配对区的前5
‑
9个碱基被修饰碱基代替，所述探针的3
’‑
OH用MGB进行封闭。
[0008]优选的，所述探针有多个，探针覆盖核糖体RNA或球蛋白RNA区域不低于核糖体RNA或球蛋白RNA全长RNA的1/6，探针在核糖体RNA或球蛋白RNA上分布均匀，探针之间的距离不超过100nt，所述的修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU、2
‑
O
‑
甲基核糖、5
‑
羟基丁酸酰基
‑
脱氧尿苷、2
‑
氨基脱氧腺苷或5
‑
甲基脱氧胞苷修饰。
[0009]优选的，核糖体RNA为人的5.8S rRNA，探针为下表所示的5.8S probe的混合物：
[0010][0011]优选的，探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
[0012]优选的，所述核糖体RNA为人的18S rRNA，探针为下表所示的18S probe的混合物：
[0013][0014][0015]优选的，探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
[0016]优选的，所述核糖体RNA为人的28S rRNA，探针为下表所示的28S probe的混合物：
[0017][0018][0019][0020]优选的，探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
[0021]优选的，所述核糖体RNA为人的12S rRNA，探针为下表所示的12S probe的混合物：
[0022][0023]优选的，探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
[0024]优选的，所述核糖体RNA为人的16S rRNA，探针为下表所示的16S probe的混合物：
[0025]优选的，探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
[0026]优选的，探针为下表所示的Globin probe的混合物：
[0027]优选的，探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
[0028]上述的探针在RNA建库中快速去除核糖体RNA或球蛋白RNA的应用。
[0029]优选的，其步骤包括：
[0030](1)提取样本中的总RNA，在总RNA中加入探针，高温变性后退火反应；
[0031](2)在反应产物中加入逆转录缓冲液和一链cDNA合成酶混合物，进行逆转录反应；
[0032](3)RNA NGS建库。
[0033]CN202110257924.X公开的二元逆转录探针是与靶RNA形成双螺旋，该双螺旋结构在遇到具有解旋酶活性的逆转录酶时会被解开从而无法阻碍逆转录。本专利技术提供一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA和球蛋白RNA的探针及方法，原理是利用探针与核糖体RNA或球蛋白RNA通过互补配对形成三元封闭复合物(Triple complex)。探针长度为35
‑
60nt，探针的后半区域与靶RNA严格互补配对，探针配对区域的5
’
端5
‑
9个碱基被修饰碱基代替，用于增强与靶RNA结合的强度和能力；探针的前半区域是嘧啶碱基，用于嵌合到DNA/RNA双链的大沟中形成三元复合物。探针的3
’‑
OH利用MGB进行封闭，用于防止探针作为引物进行延伸；同时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针，所述探针长度为35
‑
60 nt，由前半部分的嵌合区和后半部分的配对区组成，所述嵌合区为嘧啶碱基，所述配对区与靶RNA严格互补配对，且配对区的前5
‑
9个碱基被修饰碱基代替，所述探针的3
’‑
OH用MGB进行封闭。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述探针有多个，探针覆盖核糖体RNA或球蛋白RNA区域不低于核糖体RNA或球蛋白RNA全长RNA的1/6，探针在核糖体RNA或球蛋白RNA上分布均匀，探针之间的距离不超过100 nt，所述的修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU、2
‑
O
‑
甲基核糖、5
‑
羟基丁酸酰基
‑
脱氧尿苷、2
‑
氨基脱氧腺苷或5
‑
甲基脱氧胞苷修饰。3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：核糖体RNA为人的5.8S rRNA，探针为下表所示的5.8S probe的混合物：序号序列名称5
’‑3’
15.8Sprobe
‑
1TCCCCTCCTCCCTCCTTTATATCGACGCACGAGCCGA 25.8Sprobe
‑
2CCTCTCTTTCTTCTTCCTATCGATGATCAATGTGTCC 35.8Sprobe
‑
3TTCCTCCCCCCCCTTCCTATCGTAGCCCCGGGAGGAA。4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于：探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。5.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述核糖体RNA为人的18S rRNA，探针为下表所示的18S probe的混合物：序号序列名称5
’‑3’
118Sprobe
‑
1TCTCTCTTTCTTTTTCCCTTATTGGCTTAATCTTTGAGACA218Sprobe
‑
2TTTCCCTCTTTTTTTCTCTTATACTGATTTAATGAGCCATT318Sprobe
‑
3TTCTCTCCTTTTTCTTCTTATTCTAGAATTACCACAGTT418Sprobe
‑
4CTTCCCTCCTTTTTTCTCTATCTGATAAATGCACGCATC518Sprobe
‑
5CCCCCCCCCCCCCCTTTCTATCAAAGCCGCCGGCGCCCG618Sprobe
‑
6TCCCCCCCTCCTCCCTTTTATAATGGGTCGTCGCCGCCA718Sprobe
‑
7TCCTTCCTCTCCTCCCCTTATACCCGTGGTCACCATGGT818Sprobe
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8TCCCCTTCCTCTTCCTTCTATCTTGGATGTGGTAGCCGT918Sprobe
‑
9CCTCCTTCTCTCCTTTTTATTTTTCGTCACTACCTCC 1018Sprobe
‑
10TCTCCTCTTTTTTTCCTTTATAAGGATTTAAAGTGGACT 1118Sprobe
‑
11CCTCCTTTTCCCTTTTTTTATAATATACGCTATTGGAGC 1218Sprobe
‑
12CCCTCCCCCCCCCCCCTCTATGACCGCCCGCCCGCTCCC 1318Sprobe
‑
13CCTCCTTCCTCTTTCCTCTATCAGCTAAGAGCATCGAGG 1418Sprobe
‑
14TCTTTTTTTTTCTCTCTTCTTATTGAACACTCTAATTTTTTCA 1518Sprobe
‑
15TCCTCCCCCCTTCTTTTTTATAAATAGAACCGCGGTCCT 1618Sprobe
‑
16CCCCCTTTCCTTTTCCCCTATGCGCAATACGAATGCCCC 1718Sprobe
‑
17TCTCCCTTTCCTTTTCCCTATGGCAAATGCTTTCGCTCT 1818Sprobe
‑
18TTCTCTTTCCCTCCTTCTTATACTACGACGGTATCTGAT 1918Sprobe
‑
19TTTCCCTTCTCCCCCCCTATCGGCGGGTCATGGGAAT
ꢀ
2018Sprobe
‑
20TTCCTTTCCTCTTTCTTTTTATTTAAGTTTCAGCTTTGCAA 2118Sprobe
‑
21CCCCTTTTTTTCTCTCTTTATTTGAGTCAAATTAAGCCG 2218Sprobe
‑
22CTCTCTTTCTTTCCTCTTTATAAGAGCTATCAATCTGTC 2318Sprobe
‑
23TTTTCTCTCCTTTTTTCCTATGGAATTAACCAGACAAAT 2418Sprobe
‑
24TCCCCCCTCCCCTCCCCCTATCGCCGACCGCTCGGGGGT 2518Sprobe
‑
25TTTCTCCTTTTTCTCCTCTTATAGACCTGTTATTGCTCAAT 2618Sprobe
‑
26TCTCTCTCTCCCTCTCCCTTATACGCTGAGCCAGTCAGTGT 2718Sprobe
‑
27TCCTCTTCCCCTTCCCCCTTATTCCCCGATCCCCATCACGA 2818Sprobe
‑
28CTCCCCCTCTTTTCCTTCCCTATCGCAAGCTTATGACCCGCAC 2918Sprobe
‑
29CCTCCCTTCTTCCCTTTCCTTATTCCAATCGGTAGTAGCGACG 3018Sprobe
‑
30TCCCCCTCCCCTCTCTTCTCTATGTCTTCTCAGCGCTCCGCCA 3118Sprobe
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31CCTTTCTTCCTTTCCCTTCCTATCCTACGGAAACCTTGTTACG。6.根据权利要求5所述的探针，其特征在于：探针3
’
端
‑
MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。7.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述核糖体RNA为人的28S rRNA，探针为下表所示的28S probe的混合物：序号序列名称5
’‑3’ꢀ
128Sprobe
‑
1TCCTTTCCCTCTCTTTCCCTATCCGTTACTGAGGGAATCCT 228Sprobe
‑
2CCCCCCCCCCCCCCCTCTTCTATCATGTCCCGCGCCCCGCCGC 328Sprobe
‑
3TCCCCCCCCCTTCTCCTTCTTATAGAAGGACTTGGGCCCCCCA 428Sprobe
‑
4CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTATCGGGCCCGGCGCGCCGGGGG 528Sprobe
‑
5CTTTCCCCCTCCTTTTCTCCTATGGAGTTTACCACCCGCTTTG 628Sprobe
‑
6CCTTTCCCTTTCTTCTTTTCTTATTCTTTTCAACTTTCCCTTACG 728Sprobe
‑
7CTTTTCTCCTTTTCCCCTCCTATCCACCCGTTTACCTCTTAAC 828Sprobe
‑
8CCCCCCCTCTCCCCCCCCCTATGGGCCGCCGACACGGCCGG 928Sprobe
‑
9CTCCCCCCCTCCCTTCCCTATGGGAAGGGAGGGCGGGTG 1028Sprobe
‑
10CCCCCCCTCCCCCCCCCCCCTATCCCCGCCCGCCCACCCCCGC 1128Sprobe
‑
11CCCCCCCCCCCCCCCCCTTTATATGCGCCCGGCGGCGGCCG 1228Sprobe
‑
12TCCCCCTCCCCTCCCTTCCCTATGCCTTCCCAGCCGTCCCGGA 1328Sprobe
‑
13CCCCCCCCTCCTCCCTCCCTATCCGAGGGAGGACGCGGGGC 1428Sprobe
‑
14CCTCCCCCCCCCCCCCCCTATGCCGCCGCCGCCCCGACC 1528Sprobe
‑
15CCCCTCTCTTTCTCCCCCTATGGGGCTGTAACACTCGGG 1628Sprobe
‑
16CCCCTCCCCCCCCTCTCCTATGGAGAGCGCGGCGACGGG 1728Sprobe
‑
17CCCCCCTCCCCCCTCTCCCTATGGGAGACCCCCCTCGCGGG 1828Sprobe
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18CCCCCTCCCCTCCCTCCCCTATCCCGTGGGAGGGGTGGCCC 1928Sprobe
‑
19CCTCCCCCCCCCCCCTCCCTATCCGACCCGCGCGCGGCACC 2028Sprobe
‑
20CTCCCCCCCTCCCCCCCCCTATCCGGGCCCGACGGCGCGAC 2128Sprobe
‑
21CCTCCCTCCCCTCCCCCTCCTATCGACCCCGTGCGCTCGCTCC
ꢀ
2228Sprobe
‑
22TCCCTCCTTCCTCTCTTTCTTATTGTTAGACTCCTTGGTCCGT 2328Sprobe
‑
23CTTCCCCCCCCCCCTCCCCTATGGCGAGCGCGCCGGCCTTC 2428Sprobe
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24CCCCTCCCCCCTCCTCCCCTATCCGGTGGTGCGCCCTCGGC 2528Sprobe
‑
25TCCTCCCCTTTCTTCCTCTTTATTTCACCATCTTTCGGGTCCT 2628Sprobe
‑
26CCTTCCCTCTCCTTTCTCTCTATCAGAGTTTCCTCTGGCTTCG 2728Sprobe
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27TTCCCTCTCCTTTCCTCCCTATGCCAGCTATCCTGAGGGAA 2828Sprobe
‑
28TCCCCCCCTTTCCTTCTCTTATTGAGATCGTTTCGGCCCCA 2928Sprobe
‑
29CTCTCCCTTCTCCCCCTCTTATAGTGGCCCACTAGGCACTC 3028Sprobe
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30CCCCTCTTTTCCTCTTCCTTATACCAACACCTTTTCTGGGG 3128Sprobe
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31TCCCCTTTCTTCTTCCCCTTATAGGGCTAGTTGATTCGGCA 3228Sprobe
‑
32CCCCCCCCCCCCCCTCTCCTATCCACACGCGCGCGCGCGCG 3328Sprobe
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33CCCTCCTCCCCTCCTCCTATGGAGGAGGGGAGGAGGC 3428Sprobe
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34CTCCCTTCTTCCCTTCCCCTATGCCCTAGGCTTCAAGGCTC 3528Sprobe
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35CTCTTCTTTCTTCCCCCTTCTATCTTCGGCCTTCAAAGTTCTC 3628Sprobe
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36CCCTTCCCCTCCCTTCCCCTATGGGCAACGGAGGCCATCGC 3728Sprobe
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37CCCTCCCCTCCTCTCCCCTTATACCGCACTGGACGCCTCGC 3828Sprobe
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38TTCCCTTCCCCCCCTCTCTATCTCTCGGGGCGAACCCAT 3928Sprobe
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39CTTCTTTTTCCCCCCCTCTCTATCTCTCCCCCGGATTTTCAAG 4028Sprobe<...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，江翱，曹振，陈晶晶，侯策，王嫚，刘倩，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：