一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法技术

本发明专利技术提供一种组合物及其氧化5

【技术实现步骤摘要】
一种组合物及其氧化5
‑
甲基胞嘧啶的方法


[0001]本专利技术涉及测序文库构建
，具体涉及一种组合物及其氧化5
‑
甲基胞嘧啶的方法。

技术介绍

[0002]早在1925年，DNA双螺旋结构鉴定之前，DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰，是DNA序列之外的遗传因素。由于受到机体
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环境因素的双重调控，DNA甲基在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。
[0003]重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后的PCR过程中，采用U 耐受的聚合酶，将U识别为胸腺嘧啶(T)，实现C到T的转化，从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95％的C会被转化为T)，可覆盖全基因组70～99％的胞嘧啶，实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解，需要较高的DNA投入量，对于DNA含量较少的样本不友善，例如血浆游离DNA。另外重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T，而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95％以上，因此，使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库，碱基平衡性差(A、T碱基总数占比>80％)，测序时需要添加 15％的噬菌体PhiX DNA平衡，造成测序数据大量浪费。最后WGBS产生的数据测序质量差，而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark)，比对率较差，通常只有70％左右，进一步造成数据的浪费。
[0004]现有研究表明，在一定条件下，甲基化C可以被10
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11转位酶转为羧基化C，通过吡啶硼烷可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，经过测序，可以识别为T，进而区分甲基化C与未甲基化C。鉴于此原理，通过自配试剂，开发全基因组甲基化非亚硫酸氢盐文库构建技术，该技术有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷，同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。但是，甲基化C转化为T的转化率有待进一步提升。

技术实现思路

[0005]根据第一方面，一种实施例中提供一种组合物，所述组合物含有如下组分：缓冲剂、金属盐、α
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酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷(ATP)、二硫苏糖醇(DTT)，所述组合物的p H为4.3～7.5。
[0006]根据第二方面，一种实施例中提供一种反应混合物，所述反应混合物含有第一方面所述组合物。
[0007]根据第三方面，一种实施例中提供一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述组合物。
[0008]根据第四方面，一种实施例中提供第一方面组合物，和/或第二方面所述试剂盒在氧化5
‑ꢀ
甲基胞嘧啶中的应用。
[0009]根据第五方面，一种实施例中提供一种氧化5
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甲基胞嘧啶的方法，包括使含有5
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甲基胞嘧啶(5mC)的DNA样本与第一方面所述组合物和/或第二方面所述试剂盒的组分接触，使样本中5
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甲基胞嘧啶残基氧化，得到含有氧化的5
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甲基胞嘧啶残基的DNA。
[0010]根据第五方面，一种实施例中提供一种检测DNA样本中5
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甲基胞嘧啶残基的存在和位置的方法，所述方法包括：
[0011]1)使用第五方面所述方法，使片段化的且连接有接头的DNA样本中5
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甲基胞嘧啶残基氧化，得到含有氧化的5
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甲基胞嘧啶残基的DNA；
[0012]2)使所述含有氧化的5
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甲基胞嘧啶残基的DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述氧化的5
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甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而得到含有二氢尿嘧啶 (DHU)残基代替所述氧化的5
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甲基胞嘧啶残基的DNA；
[0013]3)对所述含有二氢尿嘧啶残基的DNA进行扩增和测序。
[0014]依据上述实施例的一种组合物及其氧化5
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甲基胞嘧啶的方法，通过重新设计组合物的p H，使得5
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甲基胞嘧啶转化为T(胸腺嘧啶)的转化率显著提高，可用于氧化5
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甲基胞嘧啶，检测DNA样本中5
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甲基胞嘧啶残基的存在和位置。
附图说明
[0015]图1为实施例1中氧化缓冲液不同pH条件下，TaqI
‑
v2酶切鉴定140～160bp甲基化标准品中5mC转化为T的效率结果图。
[0016]图2为实施例1中氧化缓冲液不同pH条件下，Image J计算140～160bp甲基化标准品中 5mC转化为T的效率结果图。
[0017]图3为实施例1中NGS测序计算的转化率结果图。
[0018]图4为实施例1中的质控结果图。
[0019]图5为实施例2中的TaqI
‑
v2酶切鉴定、Image J计算、NGS测序计算结果图。
具体实施方式
[0020]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0021]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0022]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
[0023]如本文所用，“NGS”是指第二代测序，又称“下一代测序”，相比于传统的基于桑格尔(S anger)和毛细电泳法的方法具有增加的通量，例如能够一次产生数十万相对较小序列读段。二代测序技术的一些实例包括但不限于合成测序、连接测序以及杂交测序。在一实施例中，二代测序包括但不限于Illumina循环SBS法、华大DNA纳米球扩增技术等等，二代测序平台包括但不限于Geneseq 2000测序平台、MGISE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有如下组分：缓冲剂、金属盐、α
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酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷、二硫苏糖醇，所述组合物的pH为4.3～7.5。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有如下浓度的组分：167
±
20mM缓冲剂、333
±
20mM金属盐、3.3
±
0.2mMα
‑
酮戊二酸盐、6.67
±
1mM抗坏血酸、4
±
0.5mM三磷酸腺苷、8.33
±
1mM二硫苏糖醇；和/或，所述组合物含有如下浓度的组分：167mM缓冲剂、333mM金属盐、3.3mMα
‑
酮戊二酸盐、6.67mM抗坏血酸、4mM三磷酸腺苷、8.33mM二硫苏糖醇。3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂包含4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种；和/或，所述金属盐包含氯化钠；和/或，所述组合物为用于氧化DNA分子中5
‑
甲基胞嘧啶残基的组合物；和/或，所述组合物所氧化的待测样本为用于NGS测序、三代测序或PCR检测的样本。4.一种反应混合物，其特征在于，所述反应混合物含有权利要求1～3任意一项所述组合物。5.如权利要求4所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物还含有TET酶，所述TET酶包含TET1、TET2、TET3中的至少一种。6.如权利要求5所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物中TET酶的终浓度为2～10μM；和/或，每50μL所述反应混合物中加有7～15μL权利要求1～3任意一项所述组合物，优选为15μL；和/或，每50μL所述反应混合物中加有4～8μL所述TET酶，优选为4μL。7.如权利要求4所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物还含有Fe
2+
；和/或，所述反应混合物中Fe
2+
的终浓度为50～100μM，优选为100μM；和/或，所述反应混合物还包括有机硼烷，用于有效地使所述氧化的5
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甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而得到含有二氢尿嘧啶(DHU)残基代替所述氧化的5
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甲基胞嘧啶残基的DNA；和/或，所述反应混合物不含亚硫酸氢盐；和/或，所述反应混合物所氧化的待测样本为用于NGS测序、三代测序或PCR检测的样本。8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～3任意一项所述组合物。9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于存放权利要求1～3任意一项所述组合物的容器；和/或，所述试剂盒还包括TET酶以及用于独立存放TET酶的容器；和/或，所述试剂盒还包括含有Fe
2+
的化合物以及用于独立存放所述含有Fe
2+
的化合物的容器；和/或，所述试剂盒还包括有机硼烷以及用...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈璐，刘佳慧，赵美茹，钟文星，易鑫，伍佳豪，
申请(专利权)人：深圳吉因加医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：