【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学分析检测，涉及一种用于检测目标微生物的标记物的筛选方法及其应用。
技术介绍
1、近年来随着分子诊断技术的发展，二代测序技术(ngs)在临床病原检测中已有初步应用，例如宏基因组二代测序技术(mngs)方法，可以在24-48小时内快速出具检测报告，但费用昂贵，实验操作复杂，且对于检测结果如何解读也是一大难题，降低了其临床实用价值。ntm的临床诊断需要一种相较于mngs灵敏度更高、特异性更强、周期更短、价格更低、解读更简单的二代测序检测方法，靶向捕获测序方法(tngs)应运而生。根据技术路线的不同，tngs可以分为基于多重pcr或探针杂交捕获的方法，对目标区域进行富集和捕获，结合高通量测序技术进行测序，最后通过生物信息学方法来检测样本中被富集的病原序列。
2、由于基因组序列特征的复杂多样性，包括gc含量不均、重复序列特征、回文序列结构特征等都将可能会影响目标区域的富集效率。现有的策略一般是先初筛选一些靶标区域，后续再根据实验结果进行优化调整，从而达到较好的产品性能。这一策略虽然最终可以得到相对较好的性能结果，但由于该过程是基于实验结果导向的优化，因此研究者会花费大量时间去进行优化实验进而筛选得到富集效率更高的靶标区域，导致效率低下。如果能够在早期就可以预测出哪些靶标区域会导致探针捕获效率低，研究者就能够根据这一预测结果对靶标序列的筛选策略早期进行调整，从而减少实验优化时间，将大大提高富集效率。
3、已有研究表明gc含量是影响富集效率的重要因素，然而由于基因序列的复杂多样性，仍然可能会有其
技术实现思路
1、为了解决上述至少一个技术问题，本公开提供了一种用于筛选目标微生物的标记物的方法，所述目标微生物包括多个亚型，所述方法包括以下步骤：
2、(1)将所述目标微生物的一个亚型的基因组序列与全物种的基因组序列进行比对，获得与该目标微生物具有序列同一性≥80％且与其他物种的序列同一性≤30％的序列集，作为所述目标微生物的种间特异性序列；和
3、(2)将所述种间特异性序列与所述目标微生物的其他亚型的基因组序列进行比对，获得与所述其他亚型的序列同一性≥80％的第一序列集，作为所述目标微生物的种内保守性序列。
4、在一些实施方式中，所述步骤1)还包括：
5、在比对前，过滤掉所述目标微生物的基因组序列上的重复序列和与所述目标微生物的宿主的基因组序列同一性≥75％、≥76％、≥77％、≥78％、≥79％、≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.1％、≥99.2％、≥99.3％、≥99.4％、≥99.5％、≥99.6％、≥99.7％、≥99.8％、≥99.9％或100％的序列；和/或
6、在比对前，对所述目标微生物的基因组序列进行拆分，得到10～200bp的片段，在比对后将拆分的片段拼接成所述种间特异性序列；
7、其中，所述拆分优选按照1～100bp的步长进行滑动拆分。
8、在一些实施方式中，所述拆分包括将所述目标微生物的基因组序列拆分成长度为10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp、75bp、76bp、77bp、78bp、79bp、80bp、81bp、82bp、83bp、84bp、85bp、86bp、87bp、88bp、89bp、90bp、91bp、92bp、93bp、94bp、95bp、96bp、97bp、98bp、99bp、100bp、101bp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、110bp、111bp、112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bp、149bp、150bp、151bp、152bp、153bp、154bp、155bp、156bp、157bp、158bp、159bp、160bp、161bp、162bp、163bp、164bp、165bp、166bp、167bp、168bp、169bp、170bp、171bp、172bp、173bp、174bp、175bp、176bp、177bp、178bp、179bp、180bp、181bp、182bp、183bp、184bp、185bp、186bp、187bp、188bp、189bp、190bp、191bp、192bp、193bp、194bp、195bp、196bp、197bp、198bp、199bp或200bp的片段。
9、在一些实施方式中，所述拆分优选按照1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp、75bp、76bp、77bp、78bp、79bp、80bp、81bp、82bp、83bp、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于筛选目标微生物的标记物的方法，其特征在于，所述目标微生物包括多个亚型，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)还包括：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)还包括：
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物为非结核分枝杆菌；
6.一种使用权利要求1～5任一项所述方法筛选得到的标记物。
7.根据权利要求6所述的标记物，其特征在于，所述标记物用于检测非结核分枝杆菌。
8.一种探针组，其用于捕获权利要求6或7所述的标记物。
9.根据权利要求8所述的探针组，其特征在于，所述探针组用于检测非结核分枝杆菌的探针组，优选地，所述探针组含有SEQ ID NO:1～180所示核苷酸序列中的任一项或多项或与其有至少60％的序列同一性的核苷酸序列。
10.一种用于检测非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求8或9所述的探针组。
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