【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因测序领域，尤其是基于dna构建文库的方法、装置及其应用。
技术介绍
1、目前为止，寡核苷酸引物或探针的质控方法被广泛地分为两类：合成后片段及纯度质控和实际使用效果质控，其中：
2、合成后质控以及混合后质控主要监测引物或探针的纯度，不同长度的寡核苷酸的质控方式也不同。通常来讲，小于70nt的寡核苷酸通常使用高效液相色谱法质控，大于70nt的寡核苷酸则选用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行质控。此外，也有方法通过使用质谱分析寡核苷酸，通过电喷雾离子化，核酸产生不同价态的离子电荷分布，利用去卷积计算核酸的分子量，从而对20-100nt的寡核苷酸进行质控。
3、上述技术手段不能区分相同核苷酸组成，或者不同连接顺序的核酸(同分异构体)：由于探针组或引物组中通常含有几千，甚至上万条寡核苷酸链，对于相同长度的寡核苷酸链，在其混合后无法确定其中中的某条或某几条探针是否有漏混，多混的现象；也无法对核苷酸合成序列错误的情况进行质控。
4、通常来说，纯化后质控可以通过对靶序列的实际富集情况来间接判断，通过多重pcr后构建文库或者通过先文库构建，再进行探针杂交捕获实验，将得到的富集后的文库进行上机测序，从测序结果中利用生物信息学的方法计算待质控引物或探针富集的区域深度与平均深度，并通过计算得到深度系数(靶区域深度/平均深度)，根据深度系数的高低来判断探针或引物的作用效果，如果某条探针或引物的靶区域深度系数过低，或者深度系数为0时，则考虑该条探针或引物质量差或缺失。
5、但是这种传统的间接质控的方法很
6、而且，实际的评估实验往往需要额外花费大量的时间及人力成本，由于探针生产商和探针使用商往往不是同一部门，对于探针引物的设计与实际交付很不理想。引物或探针靶标结合的效率具有部分随机性，尤其是在目前病原靶向富集应用(target nextgeneration sequencing，tngs)中，引物或探针的所覆盖的病原数量可达到百上千种，实际评估测试无法使用所有的病原标准品对根据数据库设计的引物或探针覆盖的所有病原进行全部评估，因此迫切需要一种方法对探针或引物进行序列质控。
7、另一方面，分子生物学中所用到的引物或者探针通常会使用5'端修饰(如引物5'端的硫代修饰；5'端的氨基修饰；5'端的巯基修饰；生物素-链霉亲和素杂交捕获体系中探针的5'端的生物素修饰)，除5'端的磷酸化修饰以外，传统的建库方案不能直接对其进行测序文库的有效构建，在不对引物或探针去除5'端非磷酸化修饰的情况下，无法实现测序质控。
8、现有的单链dna建库方法存在显著偏向性，无法得到待质控的引物探针中各引物探针的准确比例，也无法实现引物探针的半定量。
技术实现思路
1、为了解决上述至少一个问题，本公开提供了一种dna文库构建方法、装置及其应用。使用本公开所述方法，能够对探针或引物进行质控，以及半定量分析。
2、根据本公开的第一方面，提供了一种构建dna文库的方法，所述方法包括以下步骤：
3、1)在单链dna分子的3’末端添加poly(x)n尾，以得到带有poly(x)n尾的第一单链dna分子；
4、2)利用延伸引物，基于所述第一单链dna分子得到双链dna分子，其中所述双链dna分子包括所述第一单链dna分子和与所述第一单链dna分子互补的第二单链dna分子，所述延伸引物能退火到所述第一单链dna分子的3'末端的poly(x)n尾上；和
5、3)将双链接头与所述双链dna分子的远离poly(x)n尾的一端连接，并对所述第二单链dna分子进行扩增，得到扩增产物，所述扩增产物构成dna测序文库。
6、在一些实施方式中，在所述步骤1)中，所述单链dna分子长度选自10～150nt。
7、在一些具体的实施方式中，在所述步骤1)中，所述单链dna分子长度选自10nt、20nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、110nt、120nt、130nt、140nt、150nt。
8、在一些具体的实施方式中，在所述步骤1)中，所述单链dna分子长度选自20～120nt。
9、在一些实施方式中，所述单链dna分子5'末端带有修饰。
10、在一些具体的实施方式中，所述单链dna分子5'末端修饰包括非磷酸化修饰。
11、在一些具体的实施方式中，所述单链dna分子5'末端修饰包括，但不限于氨基修饰、二苯基环辛炔修饰、生物素修饰、脱硫生物素、巯基修饰、二硫醇修饰、二茂铁修饰、四氢呋喃修饰、硫代修饰、硫代磷酸酯修饰、磷硫酰修饰、地高辛修饰、胆固醇修饰、偶氮苯修饰、亚甲基蓝修饰、嵌二萘修饰、钌修饰等。
12、在一些具体的实施方式中，所述单链dna分子5'末端修饰包括硫代修饰、氨基修饰、巯基修饰或生物素修饰。
13、在一些实施方式中，在所述步骤1)中，所述n表示碱基x的数目。
14、在一些具体的实施方式中，所述n选自6至12的整数。
15、在一些具体的实施方式中，所述n选自6、7、8、9、10、11或12。
16、在一些具体的实施方式中，所述x选自a、t、c、g四种碱基中的任一种。
17、在一些具体的实施方式中，所述x选自碱基c或g。
18、在一些具体的实施方式中，所述x选自g碱基。
19、在一些实施方式中，在所述步骤1)中，使用末端转移酶，将poly(x)n尾添加到单链dna分子的3’末端。
20、在一些实施方式中，在所述步骤2)中，所述延伸引物的3’末端包括(y)m碱基单元，其中碱基y与碱基x互补，例如，当碱基x为g时，碱基y为c，m表示碱基y的数目。
21、在一些具体的实施方式中，m选自4至12的整数。
22、在一些具体的实施方式中，m选自4、5、6、7、8、9、10、11或12。
23、在一些具体的实施方式中，所述延伸引物的(y)m碱基单元的5'端还包括不与poly(x)n尾互补的一个或多个碱基。
24、在一些具体的实施方式中，所述延伸引物的长度选自20～40nt。
25、在一些具体的实施方式中，所述延伸引物的长度选自20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40nt。
26、在一些实施方式中，在所述步骤3)中，使用扩增引物进行扩增。
27、在一些实施方式中，所述扩增引物包括第一扩增引物和/或第二扩增引物。
28、在一些具体的实施方式中，第一扩增引物和/或第二扩增引物序列的长度各自独立地选自20～40nt。
29、在一些具体的实施方式中，第一扩增引物和/或第二扩增引物序列的长度各自独立地选自20、21、22、23、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建DNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述单链DNA分子长度选自10～150nt，优选自20～120nt；和/或，
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤1)中，使用末端转移酶，将poly(X)n尾添加到单链DNA分子的3'末端；
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述延伸引物的3'端包括(Y)m碱基单元，其中碱基Y与碱基X互补，其中，m选自4至12的整数；
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤3)中，使用扩增引物进行扩增，
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤3)中，所述双链接头包括：要与所述第一单链DNA分子的5'末端连接的第一接头单链；和，要与所述第二单链DNA分子的3’末端连接的第二接头单链；
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，在所述步骤3)中，所述双链接头的平末端具有一个或多个随机互补碱基对，优选具有1～10个随机互补碱基对，更优选地，所述双链接
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤3)得到的测序文库进行测序和/或进行生物信息学分析的步骤。
9.一种构建DNA文库的装置，其特征在于，所述装置包括：
10.权利要求1～8所述的方法和/或权利要求9所述的装置在探针或引物质控中的应用；优选地，所述方法和/或所述装置用于对一个或多个探针或引物进行测序，和/或对一个或多个探针或引物进行半定量或定量分析。
...【技术特征摘要】
1.一种构建dna文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述单链dna分子长度选自10～150nt，优选自20～120nt；和/或，
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤1)中，使用末端转移酶，将poly(x)n尾添加到单链dna分子的3'末端；
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述延伸引物的3'端包括(y)m碱基单元，其中碱基y与碱基x互补，其中，m选自4至12的整数；
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤3)中，使用扩增引物进行扩增，
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述步骤3)中，所述双链接头包括：要与所述第一单链dna分子的5'末端连接的第一接头单链；和，要与所述第二单链dna...
【专利技术属性】
技术研发人员：任悍，矫昕霖，刘佳慧，任重敢，谭晶晶，吴德伦，赵美茹，
申请(专利权)人：深圳吉因加医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：
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