【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于tnpb蛋白，具体涉及具有顺式切割(cis-cleavage)活性和反式切割(trans-cleavage)活性的耐高温tnpb蛋白及其应用，尤其是在核酸检测中的应用。
技术介绍
1、tnpb是属于is200/is605家族转座子编码的一种具有核酸切割活性的rna引导的核酸酶(karvelis t,druteika g,bigelyte g,et al.transposon-associated tnpb is aprogrammable rna-guided dna endonuclease[j].nature.2021,599(7886):692-696；hana t,soumya k,f esra d,et al.the widespread is200/is605 transposon familyencodes diverse programmable rna-guided endonucleases[j].science,374(6563):57-65.9；xiang,g.,li,y.,sun,j.,huo,y.,cao,s.,cao,y.,guo,y.,yang,l.,cai,y.,zhang,y.e.et al.(2023)evolutionary mining and functional characterization oftnpb nucleases identify efficient miniature genome editors[j].naturebiotechnology.)。虽然
2、此外，tnpb在进化关系上是cas12蛋白的祖先，cas12蛋白是一类广泛应用于核酸检测的蛋白，目前基于cas12已经开发了多种核酸检测工具，包括detectr，holmes等(chen,j.s.,ma,e.,harrington,l.b.,da costa,m.,tian,x.,palefsky,j.m.and doudna,j.a.(2018)crispr-cas12a target binding unleashes indiscriminate single-strandeddnase activity[j].science,360,436-439；li,s.y.,cheng,q.x.,wang,j.m.,li,x.y.,zhang,z.l.,gao,s.,cao,r.b.,zhao,g.p.and wang,j.(2018)crispr-cas12a-assistednucleic acid detection[j].cell discov,4,20.)。tnpb作为cas12家族蛋白的祖先，是否存在可以用于核酸检测的反式切割活性尚不清楚，制约了基于tnpb的核酸检测技术开发。
3、到目前为止，已报道的tnpb大多数来源于中温细菌，并且是用于基因组编辑。嗜热微生物来源的tnpb蛋白具有天然的耐热特性，有望开发得到耐高温的tnpb蛋白，可以适用于体外检测的各种高温条件，在核酸检测领域具有巨大的应用潜力。
技术实现思路
1、本专利技术旨在获得耐高温且能够用于核酸检测的tnpb蛋白，并基于该蛋白构建核酸检测体系，为核酸检测提供一种新型工具。
2、本专利技术的技术方案具体如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种耐高温tnpb蛋白，具体为以下任一：
4、a1)sis_tnpb蛋白，为氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白，或为氨基酸序列与seq id no.1所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
5、a2)sso_tnpb蛋白，为氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白，或为氨基酸序列与seq id no.2所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
6、a3)sto_tnpb蛋白，为氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白，或为氨基酸序列与seq id no.3所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
7、a4)tsi_tnpb蛋白，为氨基酸序列如seq id no.4所示的蛋白，或为氨基酸序列与seq id no.4所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
8、a5)tvo_tnpb蛋白，为氨基酸序列如seq id no.5所示的蛋白，或为氨基酸序列与seq id no.5所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白。
9、本专利技术从不同嗜热微生物中分离鉴定了上述5种tnpb，这些tnpb与已报道的tnpb相似度很低，并且具有与已报道特异性dna识别和顺式切割活性不同的反式切割活性(也成称为附带核酸酶活性)，即：在靶标序列存在的条件下，该tnpb蛋白可以在高温下(65-85℃)非特异性切割其他的单链dna、双链dna和单链rna。利用tnpb蛋白的反式切割活性，可实现核酸检测。
10、本专利技术所述的与seq id no.1～5所示蛋白中任一蛋白具有高度序列相似性且功能相同的蛋白，具体是指在对应氨基酸序列的基础上，进行一个或多个碱基的替换、缺失、改变或插入，或者在其n端或c端添加1至10个氨基酸残基，从而获得的蛋白。
11、本专利技术第二方面提供了一种引导上述耐高温tnpb核酸酶发挥反式切割活性的ωrna分子，所述ωrna分子包括两个部分，分别为：含有发卡结构的rna片段以及3’末端的引导序列(即guide)。
12、优选地，ωrna分子的长度为200～250nt，引导序列的长度为16-20nt。
13、优选地，含有发卡结构的rna片段由对应tnpb基因末端的保守序列所编码，各rna片段的序列具体为：
14、b1)sis_ωrna，核苷酸序列如seq id no.6所示；
15、b2)sso_ωrna，核苷酸序列如seq id no.7所示；
16、b3)sto_ωrna，核苷酸序列如seq id no.8所示；
17、b4)tsi_ωrna，核苷酸序列如seq id no.9所示；
18、b5)tvo_ωrna，核苷酸序列如seq id no.10所示。
19、在上述ωrna分子中，引导序列与靶标序列互补配对，且靶标序列5’端相邻连接有tam(transposon associated motif)序列。
20、本专利技术所述的“靶标序列”是指被ωrna分子中的引导序列所靶向的多核苷酸，例如与该引导序列具有互补性的序列，其中靶标序列与引导序列之间的杂交将促进tnpb复本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种耐高温TnpB蛋白或所述耐高温TnpB蛋白与ωRNA分子形成的蛋白复合物在核酸检测中的应用，所述耐高温TnpB蛋白具有反式切割活性，所述耐高温TnpB蛋白为Sis_TnpB蛋白、Sso_TnpB蛋白、Sto_TnpB蛋白、Tsi_TnpB蛋白、Tvo_TnpB蛋白中的一种；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ωRNA分子包含发卡结构和位于末端的引导序列，所述引导序列与靶标序列互补配对，所述靶标序列末端连接有TAM序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Sis_TnpB蛋白的TAM序列为5’-TTTAA，所述Sso_TnpB的TAM序列为5’-TTTAT或5’-ATTAT，所述Sto_TnpB蛋白的TAM序列为5’-TGAC，所述Tsi_TnpB的TAM序列为5’-TTAC，所述Tvo_TnpB蛋白TAM序列为5’-TGAC。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Sis_TnpB蛋白的ωRNA分子的发卡结构序列如SEQ ID NO.6所示，所述Sso_TnpB蛋白的ωRNA分子的发卡结构序列如SEQ I
5.一种核酸检测体系，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的核酸检测体系，其特征在于，所述核酸为双链DNA和/或单链DNA，所述分子信标为双链DNA、单链DNA和单链RNA中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的核酸检测体系，其特征在于，所述缓冲液中含有金属离子Mg2+和/或Mn2+。
8.一种核酸检测方法，其特征在于，将TnpB蛋白和ωRNA分子形成的蛋白复合物、包含待测靶标序列的核酸样本、两端分别带有荧光基团和淬灭基团的分子信标加入缓冲液中，于65-85℃的环境中反应，检测荧光信号。
9.如权利要求1所示的耐高温TnpB蛋白或耐高温TnpB蛋白与ωRNA分子形成的蛋白复合物在制备核酸检测试剂盒中的应用。
10.如权利要求5所示的核酸检测体系在区分病毒不同突变株中的应用，所述病毒包括SARS-Cov2和HPV。
...【技术特征摘要】
1.一种耐高温tnpb蛋白或所述耐高温tnpb蛋白与ωrna分子形成的蛋白复合物在核酸检测中的应用，所述耐高温tnpb蛋白具有反式切割活性，所述耐高温tnpb蛋白为sis_tnpb蛋白、sso_tnpb蛋白、sto_tnpb蛋白、tsi_tnpb蛋白、tvo_tnpb蛋白中的一种；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ωrna分子包含发卡结构和位于末端的引导序列，所述引导序列与靶标序列互补配对，所述靶标序列末端连接有tam序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述sis_tnpb蛋白的tam序列为5’-tttaa，所述sso_tnpb的tam序列为5’-tttat或5’-attat，所述sto_tnpb蛋白的tam序列为5’-tgac，所述tsi_tnpb的tam序列为5’-ttac，所述tvo_tnpb蛋白tam序列为5’-tgac。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述sis_tnpb蛋白的ωrna分子的发卡结构序列如seq id no.6所示，所述sso_tnpb蛋白的ωrna分子的发卡结构序列如seq idno.7所示，所述sto_tnpb蛋...
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