一种石蜡包埋组织的DNA提取试剂盒以及提取方法技术

本发明专利技术涉及一种石蜡包埋组织的DNA提取试剂盒以及提取方法，属于基因检测技术领域。提取试剂盒中包含：脱蜡剂，用于对样本进行脱蜡处理；裂解缓冲液和蛋白酶，用于对样本进行消化处理；结合缓冲液和磁珠、用于对消化产物中的DNA进行结合；洗涤液和乙醇，用于对结合了DNA的磁珠进行洗涤；洗脱液，用于将磁珠上结合的DNA进行洗脱。本专利的方法可以有效地对石蜡包埋组织中的DNA进行提取，具有提取效率高、提取质量好的优点。提取质量好的优点。提取质量好的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种石蜡包埋组织的DNA提取试剂盒以及提取方法


[0001]本专利技术涉及一种石蜡包埋组织的DNA提取试剂盒以及提取方法，属于基因检测


技术介绍

[0002]恶性胶质瘤包括间变性少突胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、间变性少突星形细胞瘤及胶质母细胞瘤。恶性胶质瘤接受甲基苄肼/环己亚硝脲/长春新碱(PCV)联合化疗方案治疗中发现，1号染色体短臂(1p)杂合缺失及联合19号染色体长臂(19q)杂合缺失的间变性少突胶质细胞瘤的预后明显好于同级别的星型细胞瘤；并在随后的研究中发现1p/19q的联合缺失与化疗的敏感性相关，且1p/19q联合缺失的间变少突胶质瘤具有较长的生存期。因此1p/19q杂合缺失可以用于少突胶质细胞肿瘤的管理，在临床上作为评价诊断、治疗及预后判断的指标。替莫唑胺为第二代烷化剂，一直以来被用于恶性胶质瘤的化学治疗。替莫唑胺易通过血脑屏障且毒副作用和不良反应小。06
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甲基鸟嘌呤
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DNA
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甲基转移酶(O6
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methyl guanine
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DNA
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methyl transferase，MGMT)具有DNA修复作用，能导致替莫唑胺耐药，即移除DNA上鸟嘌呤O6位点的烷基化加合物，使损伤的鸟嘌呤恢复。MGMT基因在肿瘤细胞株沉默通常伴随着基因启动子CpG岛的甲基化，说明基因启动子甲基化介导肿瘤细胞MGMT蛋白表达。MGMT基因启动子甲基化在临床上被用于预测胶质母细胞瘤患者替莫唑胺化疗敏感性及预后情况。
[0003]在现有技术中，对MGMT基因启动子甲基化的检测方法主要可以分为：(1)焦磷酸测序法、(2)甲基化敏感的限制性内切酶法(MS
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RE)、(3)荧光PCR方法、(4)高通量测序法；上述的方法中，焦磷酸测序法是“金标准”方法；而高通量测序中，目前存在着操作繁琐，引物扩增效率差，成本较高等问题。为了解决以上问题，本专利技术提供了一种用于检测MGMT启动子99个CpG位点甲基化的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是：提供了一种对MGMT启动子上的99个CpG位点的甲基化水平进行检测的方法以及相关的试剂。
[0005]技术方案是：
[0006]一种用于扩增MGMT启动子上CpG位点的引物组，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5
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8所示。
[0007]一种MGMT启动子区甲基化检测文库的构建方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1，获取样本并提取DNA，对DNA通过甲基化修饰转化试剂进行处理；
[0009]步骤2，通过引物组对步骤1中得到的核苷酸进行多重PCR扩增，获得扩增产物；
[0010]步骤3，对扩增产物进行末端修补、末端加碱基A、加接头后进行扩增，再经过纯化后，得到文库。
[0011]所述的步骤1中，样本是FFPE组织样本，提取DNA是通过磁珠法获取得到。
[0012]所述的步骤2中，多重PCR扩增过程执行以下扩增程序：
[0013]92
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97℃预变性5
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15min；
[0014]92
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97℃变性20
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40s，40
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65℃退火20
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40s，70
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75℃延伸0.5
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5min，共计30
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48个循环；
[0015]70
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75℃终延伸3
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8min。
[0016]所述的步骤3中，末端修补过程中的反应液中包括：DNA 30
‑
70ul、磷酸化反应缓冲液5
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15ul、dNTP 10nM、T4DNA聚合酶1
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10ul、Klenow大肠杆菌聚合酶片段0.5
‑
2ul、T4多聚核苷酸激酶1
‑
10ul、无核酸酶水将总体积补至100ul。
[0017]所述的步骤3中，末端加碱基A的反应液中包括：DNA 20
‑
40ul、dATP 1mM、10xKlenow大肠杆菌聚合酶缓冲液1
‑
10ul、Klenow大肠杆菌聚合酶片段1
‑
5ul、无核酸酶水将总体积补至50ul。
[0018]所述的步骤3中，扩增程序95
‑
99℃预变性20
‑
40秒，95
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99℃变性20
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40秒，60
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70℃退火20
‑
40秒，70
‑
75℃延伸20
‑
40秒，共循环3～10次，最后在70
‑
75℃延伸3
‑
6分钟。
[0019]所述的步骤4中，扩增过程中的反应液组成是：加上接头后的DNA文库20
‑
40ul、10X高保真DNA聚合酶缓冲液2
‑
6ul、DNA聚合酶缓冲液0.5
‑
2ul、接头正引物1ul、接头反引物1ul、无核酸酶水将总体积补至50ul。
[0020]一种MGMT启动子甲基化检测方法，包括如下步骤：
[0021]通过上述方法获得测序文库，使用二代测序法获得发生了甲基化的CpG位点和未甲基化的CpG位点的reads数，计算出甲基化率。
[0022]一种试剂盒，包括有上述的引物组。
[0023]一种石蜡包埋组织的DNA提取试剂盒，包括：
[0024]脱蜡剂，用于对样本进行脱蜡处理；
[0025]裂解缓冲液和蛋白酶，用于对样本进行消化处理；
[0026]结合缓冲液和磁珠、用于对消化产物中的DNA进行结合；
[0027]洗涤液和乙醇，用于对结合了DNA的磁珠进行洗涤；
[0028]洗脱液，用于将磁珠上结合的DNA进行洗脱。
[0029]所述的脱蜡剂是二甲苯。
[0030]所述的裂解缓冲液中包含：5
‑
50mmol/L的Tris
‑
HCl；1
‑
5mmol/L的NaCl；5
‑
20mmol/L的EDTA；8
‑
50mmol/L的DTT；3
‑
5mol/L的异硫氰酸胍；0.5％
‑
2％的SDS；1％
‑
5％的TritonX
‑
100。
[0031]所述的蛋白酶是蛋白酶K。
[0032]所述的组合缓冲液中包含：100
‑
200mmol/L的Tris
‑
HCl；1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种石蜡包埋组织的DNA提取试剂盒，其特征在于，包括：脱蜡剂，用于对样本进行脱蜡处理；裂解缓冲液和蛋白酶，用于对样本进行消化处理；结合缓冲液和磁珠，用于对消化产物中的DNA进行结合；洗涤液和乙醇，用于对结合了DNA的磁珠进行洗涤；洗脱液，用于将磁珠上结合的DNA进行洗脱。2.根据权利要求1所述的蜡包埋组织的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的脱蜡剂是二甲苯。3.根据权利要求1所述的蜡包埋组织的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的裂解缓冲液中包含：5
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50mmol/L的Tris
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HCl；1
‑
5mmol/L的NaCl；5
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20mmol/L的EDTA；8
‑
50mmol/L的DTT；3
‑
5mol/L的异硫氰酸胍；0.5％
‑
2％的SDS；1％
‑
5％的TritonX
‑
100。4.根据权利要求1所述的蜡包埋组织的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的蛋白酶是蛋白酶K。5.根据权利要求1所述的蜡包埋组织的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的组合缓冲液中包含：100
‑
200mmol/L的Tris
‑
HCl；1
‑
5mmol/L的NaCl；1％
‑
5％的TritonX
‑
100；2
‑
4mol/L的异硫氰酸胍；20
‑
40％的异丙醇。6.根据权利要求1所述的蜡包埋组织的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液包括第一洗涤液和第二洗涤液，第一洗涤液中包含：100
‑
200mmol/L的Tris
‑
HCl；1
‑
5mmol/L的NaCl；40
‑
60％的乙醇；2
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑾，盛巧芸，蒋亚辉，张丽，缪其杰，
申请(专利权)人：南京兔牙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：