一种超微量全长RNA测序文库的构建方法技术

本发明专利技术公开超微量的全长总RNA测序文库的构建方法，包括以下步骤：1）对获得细胞或者亚细胞样本中的超微量的总RNA，进行cDNA文库的构建，获得包含rRNA序列信息的cDNA文库；2）对获得的cDNA文库进行无偏性扩增；3）根据相应物种的rRNA序列，设计sgRNA序列组合；4）将sgRNA序列组合配置的溶液与步骤扩增产生的cDNA文库进行混合，获得不包含rRNA信息的cDNA文库。本发明专利技术能够实现超微量的总RNA及全长建库，同时又能够在cDNA合成之后使用CRISPR/Cas9高效切割PCR扩增产生的含有rRNA的cDNA文库，从而避免RNA的降解；适用于超低起始量的转录组建库，且花费较低。且花费较低。且花费较低。

【技术实现步骤摘要】
一种超微量全长RNA测序文库的构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种超微量全长总RNA测序文库构建方法，尤其涉及一种基于模板转换逆转录及CRISPR/Cas9高效切割去除rRNA，同时能够通过编码进行细胞或者亚细胞样本并行测序与分析的超微量的全长总RNA转录组建库方法。

技术介绍

[0002]最近，随着高通量测序技术的发展，单细胞RNA测序技术(Single cell RNA sequencing,scRNA
‑
seq)成为可能。2009年，Tang等人发表了第一个单细胞RNA
‑
seq测序方案。但由于测序通量低，随后STRT
‑
seq和SCRB
‑
seq作为新的方法被引入，它们可以同时处理多个不同的样本，但通常会引入3
′
端或5
′
端的偏差，与之相比，Smart
‑
seq2结合模板转换方法，进行了全转录组的测序，可用于融合基因检测、单核苷酸变异(SNV)分析、可变剪切等，成为了一种单细胞全长转录组测序分析的理想方法。此外，为了减少上述方法中PCR扩增所产生的偏差，CEL
‑
seq和MARS
‑
seq方法使用体外逆转录(IVT)替代PCR扩增，获得足够多的cDNA量进行测序，且降低了PCR扩增偏差。最近，基于液滴和分裂池连接的方法能够获得数千个单细胞，为解析细胞异质性和稀有细胞类型提供的新的可能。但所有的这些方法的不足都是通过oligo<br/>‑
dT的方法进行mRNA及少量长链非编码RNA的富集，而其它的非编码RNA很难获取。这就限制了我们对非编码RNA的深入解析，成为解析单个细胞中全部转录信息的主要障碍。
[0003]目前，研究者们在努力开发单细胞全转录组RNA
‑
seq方法，如最早的SUPeR
‑
seq，利用特异性随机引物富集非polyA的RNA，包括circRNAs。然而，SUPeR
‑
seq对非polyA尾巴的RNA敏感性相对较低(20％
‑
30％)。这为研究scRNA
‑
seq测序非poly(A)尾RNAs的富集方法提供了空间。此外，一个不可忽视的问题就是在总RNA测序中，不感兴趣的RNA物种丰度(如rRNA占细胞总量的80％
‑
90％)会占据测序的容量，影响其它低丰度转录物的结果分析，同时还增加了测序的成本。目前，从总RNA中去除rRNA的方法包括两种，直接富集多聚腺苷酸化(polyA)的转录本和靶向去除rRNA。前者主要由于rRNA无polyA尾，因此可以使用oligo(dT)引物富集含polyA尾的mRNA，也由于操作步骤简单方便而成为了大多数scRNA
‑
seq富集mRNA的主要方法，包括Smart
‑
seq2/3、CEL
‑
Seq2等。然而，这种方法很容易产生偏差，因为它去除了除rRNA之外所有的非编码转录本，如长的非编码RNA(lncRNA)、3
′
末端降解的mRNA等。另一种方法，rRNA特异性去除方法，通过使用生物素标记的特异性探针(如Illumina
’
s Ribo
‑
Zero和Thermo Fisher
’
s RiboMinus)或RNase H介导的降解(如：NEB
’
s NEBNext)。虽然这些靶向去除的方法保留了大部分的非rRNA，但往往需要较高的样本投入量10ng
‑
1μg，远高于单细胞RNA量的要求，很难在scRNA
‑
seq中应用，从而限制了研究者对单细胞全转录组信息的分析。
[0004]因此为了以最高效率从scRNA
‑
seq文库中去除rRNA，研究者们提出了在cDNA合成过程中或者合成之后进行rRNA的去除，从而降低了对RNA输入量的要求。目前最具代表性的方法为以Takara为代表的scZapR and scR
‑
Probes，可在单细胞建库中高效率的去除rRNA，
但其价格及其昂贵。此外随着CRISPR技术的日益成熟，研究者开发了一种新的通过利用CRISPR/Cas9技术杂交去除非靶标序列(DASH)，其原理是Cas9核酸酶与single guide RNAs(sgRNAs)形成复合物，在特定sgRNA互补位置诱导双链断裂(DSBs)，从而去除靶基因，如rRNA。此外，研究者也应用CRISPR/Cas9从ATAC
‑
seq文库中切割去除线粒体DNA。
[0005]目前，现有技术中无法准确的对样本转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序的问题，尤其是无法去除细胞或者亚细胞样本转录组中的rRNA，亟待出现一种方法能够解决上述问题。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种能够进行超微量全长总RNA建库，同时能够高效去除rRNA。
[0007]技术方案：为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：一种超微量全长总RNA测序文库的构建方法，所述构建方法主要包括以下步骤：
[0008]1)对获得的细胞或亚细胞样本中的超微量总RNA，按照常规的方法进行cDNA文库的构建，获得包含rRNA序列信息的cDNA文库；
[0009]2)对步骤1)中获得的cDNA文库进行扩增；
[0010]3)根据细胞或亚细胞的相应物种的rRNA序列，设计特异性的sgRNA序列组合，所述的sgRNA序列组合包括SEQ ID No.1
‑
SEQ ID No.58；
[0011]4)将sgRNA序列组合配置的溶液与步骤2)扩增的cDNA文库进行混合，利用CRISPR/Cas9系统在Cas9蛋白作用下进行特异性的切割，获得不包含rRNA信息的cDNA文库。
[0012]其中，所述步骤1)细胞或者亚细胞的RNA的起始量为0.5～500pg。
[0013]其中，所述步骤2)的文库扩增可采用PCR或等温扩增。
[0014]其中，所述步骤4)中配置rRNA的sgRNA混合池及Cas9的RNP复合物的反应体系，37℃孵育0.5
‑
2h。
[0015]其中，所述步骤4)中Cas9蛋白的浓度为10nM
‑
2μM。
[0016]其中，所述步骤4)中sgRNA序列组合的浓度为0.1
‑
1μM。
[0017]其中，所述超微量全长转录组测序文库的构建方法具体包括如下步骤：
[0018]s1)将细胞或者亚细胞裂解获得RNA；
[0019]s2)RNA片段化、逆转录及模板转换：将RNA置于二价阳离子溶液、带有修饰和编码的半随机引物、dNTP、第一链合成试剂的混合液中进行片段化，其后在模板转换本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超微量全长RNA测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法主要包括以下步骤：1）获得细胞或者亚细胞样本中的超微量的总RNA，构建包含rRNA序列信息的cDNA文库；2）对步骤1）中获得的cDNA文库进行扩增；3）根据细胞或者亚细胞相应物种的rRNA序列，设计特异性的sgRNA序列组合，所述的sgRNA序列组合包括SEQ ID No.1
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SEQ ID No.58；4）将sgRNA序列组合配置的溶液与步骤2）扩增的cDNA文库进行混合，利用CRISPR/Cas9系统在Cas9蛋白作用下进行特异性的切割，获得不包含rRNA信息的cDNA文库。2.根据权利要求1所述的超微量全长RNA测序文库构建方法，其特征在于，所述细胞或者亚细胞样本中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛芹玉，施华娟，贾二腾，赵祥伟，刘芝余，白云飞，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：