一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法。本方法利用数字PCR检测平台，在一个PCR扩增体系中加入多条待检基因多种结构变异检测的正向引物、一条自对照正向引物、一条共用反向引物及两条荧光标记的探针。将目标基因组结构变异区段及非结构变异区段同时扩增，并且所扩增的非结构变异区段包含于目标基因组结构变异区段内，即以待检基因自身作为对照，显著减少多引物多扩增所带来的信号干扰，同时无需标准品即可实现转录本拷贝数检测。该方法不仅可以判定基因组结构变异的拷贝数，还可同时检测正常基因的拷贝数以及其基因组结构变异的发生频率，并且使检测结果的精准度较现有技术提高了3倍。

【技术实现步骤摘要】
一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法
本专利技术属于分子生物学核酸检测
，具体涉及一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法。
技术介绍
基因组结构变异(StructureVariantions，简称SVs)通常是指基因组上大片段基因序列和位置发生了变化，其变异类型多种多样，包括大片段基因序列的插入或丢失、串联重复、易位等，最终结果是形成新的融合基因。SVs往往给生命体带来重大的影响，例如，一些SVs直接导致出生缺陷、癌症等疾病的发生。目前针对SVs的检测多采用免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、二代测序(NGS)、RT-PCR等方法对SVs产生的新的融合基因进行鉴定。其中PCR方法以其方便、简单、低成本、结果准确等优点使其应用最为广泛，并且针对SVs的PCR检测方法，目前多使用分别扩增融合基因区域和非融合基因区域及探针杂交以得到融合基因的数量、非融合基因的数量以及融合基因在全部检测目标基因数量中所占的比例等相关数据，但是这种检测方法对检测结果的重复性、稳定性、准确性都会产生不良影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有RT-PCR检测方法对于SVs检测所存在的缺点，寻求设计提供一种基于自对照介导的使用数字PCR仪检测SVs的方法，建立一种新的高稳定性、高准确性的SVs检测方法。本方法无需建立标准曲线以及内参即可实现靶基因结构变异丰度检测，在简单准确判定SVs的同时，还可以检测SVs的拷贝数以及SVs的发生频率。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术提供一种非诊断自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其具体检测方法包括以下主要步骤：(1)同时扩增目标基因组结构变异区域与自对照基因区域及荧光信号的产生：在PCR扩增体系中加入目标基因组结构变异区域的多条正向引物、一条自对照正向引物、一条共用反向引物、一条检测自对照基因区域的分子探针、一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针；一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用与自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生单荧光信号一；一条检测目标基因组结构变异的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用分别与基因组结构变异区域及自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生双荧光信号二；(2)信号检测：使用荧光检测装置对步骤(1)中产生的单荧光信号一、双荧光信号二进行检测；所述的荧光检测装置为实时荧光定量PCR仪或数字PCR仪中的荧光检测装置。(3)数据分析：将检测到的单荧光信号一和双荧光信号二带入特定的荧光阈值、荧光补偿参数并进行数据分析，由单荧光信号一产生的分析数据为自对照基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据为目标基因组结构变异的数量，由单荧光信号一产生的分析数据减去由双荧光信号二产生的分析数据为正常基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据与单荧光信号一产生的分析数据的比值为目标基因组结构变异发生的频率。本专利技术所述的目标基因组结构变异区域的多条正向引物与一条共同反向引物的组合并在一个PCR扩增反应中同时完成多种目标基因组结构变异类型的检测；本专利技术所述的一条共用反向引物为在进行PCR扩增时，扩增目标基因组结构变异区域和扩增自对照基因区域所使用的反向引物为同一条引物；本专利技术所述的分子探针的一端标记荧光基团，荧光基团为FAM，HEX，CY5，另一端标记淬灭基团，淬灭基团为BHQ-MGB；所述的一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针需要分别标记不同的荧光基团；本专利技术所述的单荧光信号一必然包括双荧光信号二；本专利技术所述的单荧光信号一减去双荧光信号二为正常基因的荧光信号；本专利技术所述的双荧光信号二与单荧光信号一的比值为基因组结构变异发生的频率；本专利技术所述的检测方法可以针对RNA进行反转录过程和基因扩增过程结合的一步法PCR检测。本专利技术与现有技术相比，本质上是一个使用双重探针对多目标基因组结构变异进行检验的过程，因此大大提高了检测的特异性、精密度和准确度。本专利技术首先只需一条共用反向引物与多目标基因组变异区域的正向引物组合就可以实现对多种结构变异的基因组和自对照基因区域同时扩增，并以自对照为参考进行数据分析，替代了现有技术中需要使用不同的引物对正常基因组进行另外扩增来作为内参，从而避免了多引物存在下的相互干扰或者由此引起的不可避免的非特异性扩增所导致的重复性差、背景信号强等问题；其检测过程简单方便、精密度、准确度和特异性高，得以保证检测结果的正确性，并可直接得到结构变异基因组拷贝数、正常基因组拷贝数以及基因组结构变异发生频率等结果。附图说明图1为本专利技术涉及的自对照介导的基因组结构变异检测方法的基本原理示意图。以A基因的四种融合类型为例，当A基因分别与B基因的某些外显子发生融合，则针对多种A+B融合基因类型分别设计正向引物F1、F2、F3、F4，并共用反向引物R1进行扩增，使用分子探针P2(如使用HEX或VIC绿色荧光信号标记)产生荧光信号；所有A基因自对照使用正向引物F0、共用反向引物R1和分子探针P1(如使用FAM蓝色荧光信号标记)产生荧光信号。图2为非自对照介导的基因组结构变异检测方法的基本原理示意图。以A基因的四种融合类型为例，当A基因分别与B基因的某些外显子发生融合，则针对多种A+B融合基因类型分别设计正向引物F1、F2、F3、F4，并使用反向引物R1进行扩增，使用分子探针P2(如使用HEX或VIC绿色荧光信号标记)产生荧光信号；所有A基因非自对照使用正向引物F0、反向引物R0和分子探针P1(如使用FAM蓝色荧光信号标记)产生荧光信号。图3为本专利技术涉及的实施例1中ALK融合基因单类型质粒与pUC57-ALK混合后自对照方法检测的荧光信号图。图4为本专利技术涉及的实施例1中ALK融合基因单类型质粒与pUC57-ALK-F混合后非自对照方法检测的荧光信号图。图5为本专利技术涉及的实施例1中ALK融合基因10种单类型质粒混合后再与pUC57-ALK混合后自对照方法检测的荧光信号图。图6为本专利技术涉及的实施例1中ROS1融合基因单类型质粒与pUC57-ROS1混合后自对照方法的检测荧光信号图。图7为本专利技术涉及的实施例1中ROS1融合基因单质粒与pUC57-ROS1-F混合后非自对照方法的检测荧光信号图。图8为本专利技术涉及的实施例1中ROS1融合基因10种单类型质粒混合后再与pUC57-ROS1混合后自对照方法检测的荧光信号图。图9为本专利技术涉及的实施例1中NTRK1融合基因单类型质粒与pUC57-NTRK1混合后自对照方法检测的荧光信号图。图10为本专利技术涉及的实施例1中NTRK1融合基因单类型质粒与pUC57-NTRK1-F混合后非自对照方法检测的荧光信号图。图11为本专利技术涉及的实施例1中NTRK1融合基因8种单类型质粒混合后再与pUC57-NTRK1混合后自对照方法检测荧光信号图。图12为本专利技术涉及的实施例1中BCR-ABL1融合基因单类型质粒与pUC57-ABL1混合后自对照方法检测荧光信号图。图13为本专利技术涉及的实施例1中BCR-ABL1融合基因单类型质粒与pUC57-ABL1-F混合后非自对照方法检测荧光信号图。图14为本专利技术涉及的实施例1中BCR-ABL1融合基因4种单类型质粒混合后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于具体检测方法包括以下主要步骤：(1)同时扩增目标基因组结构变异区域与自对照基因区域及荧光信号的产生：在PCR扩增体系中加入目标基因组结构变异区域的多条正向引物、一条自对照正向引物、一条共用反向引物、一条检测自对照基因区域的分子探针、一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针；一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用与自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生单荧光信号一；一条检测目标基因组结构变异的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用分别与基因组结构变异区域及自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生双荧光信号二；(2)信号检测：使用荧光检测装置对步骤(1)中产生的单荧光信号一、双荧光信号二进行检测；(3)数据分析：将检测到的单荧光信号一和双荧光信号二带入特定的荧光阈值、荧光补偿参数并进行数据分析，由单荧光信号一产生的分析数据为自对照基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据为目标基因组结构变异的数量，由单荧光信号一产生的分析数据减去由双荧光信号二产生的分析数据为正常基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据与单荧光信号一产生的分析数据的比值为目标基因组结构变异发生的频率。...

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于具体检测方法包括以下主要步骤：(1)同时扩增目标基因组结构变异区域与自对照基因区域及荧光信号的产生：在PCR扩增体系中加入目标基因组结构变异区域的多条正向引物、一条自对照正向引物、一条共用反向引物、一条检测自对照基因区域的分子探针、一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针；一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用与自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生单荧光信号一；一条检测目标基因组结构变异的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用分别与基因组结构变异区域及自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生双荧光信号二；(2)信号检测：使用荧光检测装置对步骤(1)中产生的单荧光信号一、双荧光信号二进行检测；(3)数据分析：将检测到的单荧光信号一和双荧光信号二带入特定的荧光阈值、荧光补偿参数并进行数据分析，由单荧光信号一产生的分析数据为自对照基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据为目标基因组结构变异的数量，由单荧光信号一产生的分析数据减去由双荧光信号二产生的分析数据为正常基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据与单荧光信号一产生的分析数据的比值为目标基因组结构变异发生的频率。2.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异检测方法，其特征在于所述的目标基因组结构变异区域的多条正向引物与一条共用反向引物组合并在一个PCR扩增反应中同时完成多种基因组结构变异类型的检测；3.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建，于祥春，高敏，黄慧，冯晓燕，林挺，
申请(专利权)人：艾普拜生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32