一种用于λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法技术方案

本发明专利技术公开了一种用于λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法。属于生物技术工程领域。本发明专利技术提供一种通用检测引物，其设计方法为在四环素tetRA基因中间约1/3处设计一对互补的引物，与原有的检测重组阳性的鉴定引物进行组合使用，分别用于检测以四环素基因tetRA为替换基因的λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的3’端序列和5’端序列。这样设计检测引物使检测重组阳性克隆有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测重组阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。

A primer and detection method for gene knockout positive clone detection of \u03bb - red recombination system

【技术实现步骤摘要】
一种用于λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法
本专利技术属于生物技术工程领域，具体涉及通过λ-Red重组系统对目标基因敲除后，对重组阳性克隆进行检测的引物及检测方法。
技术介绍
基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统目前广泛用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成：Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端，从5'端向3'端降解DNA，产生3'突出端；Beta蛋白结合在单链DNA上，介导互补单链DNA退火；Gam蛋白可与RecBCD酶结合，抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作，无需使用限制性内切酶和连接酶。四环素抗性基因tetRA作为遗传筛选标记容易检测，而且具有条件致死特性，因此常作为替换基因用于取代需要敲除的基因或插入序列。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行，大大推动功能基因组研究的发展。四环素抗性tetRA基因作为敲除目的基因的替换基因，其大小为1911bp；同源重组序列通常为目标基因两侧同源臂序列，以长度为40bp为例；用于鉴定基因是否重组的鉴定引物选择位置通常为同源重组序列外侧同源臂，以长度为18bp为例；因此用于同源重组的片段大小为1911+40+40＝1991bp；重组阳性的PCR检测结果为1991+18+18＝2027bp，相应的阴性对照大小为：原基因大小x+40+40+18+18＝x+116bp。由于待敲除基因大小不一，如果待敲除的序列与四环素抗性tetRA基因的片段大小相差较大，则阳性结果与阴性对照的片段相差较大容易识别；如果待敲除基因序列与四环素抗性tetRA基因片段大小相差较小，则由于琼脂糖凝胶电泳的分辨率问题，会导致很难识别阳性结果与阴性对照，进而无法准确判断结果。
技术实现思路
为克服现有检测方法的不足，本专利技术的目的是提供一种通用检测引物，其设计方法为在四环素tetRA基因中间约1/3处设计一对互补的引物，与原有的检测重组阳性的鉴定引物进行组合使用，分别用于检测以四环素基因tetRA为替换基因的λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的3’端序列和5’端序列。这样设计检测引物使检测重组阳性克隆有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测重组阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。本专利技术另一目的，提供一种以四环素基因tetRA为替换基因的λ-Red重组系统基因敲除重组阳性的检测方法。为了实现上述目的本专利技术采用如下技术方案：第一方面，提供一种以四环素抗性基因tetRA为替换基因的λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的检测方法，包含如下步骤：(1)设计引物：从NCBI数据库获得tetRA基因序列和待敲除的基因H的序列，设计一对引物H-tetRAR和H-tetRAF用于扩增同源重组序列，每一条引物的5’端有35～60bp，分别为待敲除的基因H上下游同源序列a或a’片段，其序列长度均为L1，3’端分别为四环素抗性基因tetRA两侧自带的引物序列b或b’片段，四环素抗性基因tetRA的序列长度为L；设计用于鉴定基因是否重组的鉴定引物JC-HF和JC-HR，其序列分别位于待敲除的基因H上下游同源序列a或a’片段的外侧的c或c’片段，引物JC-HF和JC-HR的序列长度均为L2；设计两条互补的通用引物TYJC-tetRAF和TYJC-tetRAR，通用引物的序列为四环素抗性基因tetRA内部的d片段，四环素抗性基因tetRA上从序列b至d之间的序列长度为L3，四环素抗性基因tetRA上从序列d’至b’之间的序列长度为L4；(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增；(3)感受态细胞的制备；(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定；用鉴定引物JC-HF和JC-HR检测筛选的目的菌株，目的片段长度理论值＝L2+L1+L+L1+L2；用JC-HR和TYJC-tetRAF检测筛选的目的菌株，目的片段长度理论值＝L1+L2+L4，用JC-HF和TYJC-tetRAR检测筛选的目的菌株，目的片段长度理论值＝L1+L2+L3；如果分别用JC-HF和JC-HR、JC-HR和TYJC-tetRAF或JC-HF和TYJC-tetRAR3对引物检测筛选的目的菌株获得的PCR扩增的片段长度与目的片段长度理论值接近，表明tetRA基因打靶片段已经成功的将待敲除的基因H敲除。优选地，上述检测方法中的步骤(1)所述的两条互补的通用引物TYJC-tetRAF和TYJC-tetRAR在四环素抗性基因tetRA离5’端约1/3处，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。本专利技术的技术方案的原理图如图1所示。与现有技术相比，本专利技术的优势在于：本专利技术设计的检测引物使检测阳性克隆是有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。附图说明图1为本专利技术技术方案的原理图示意图；图2用于Tar基因重组的PCR产物切胶回收电泳检测；M：DL2000DNA标样；1：四环素抗性基因胶回收产物。图3Tar基因敲除株菌落PCR鉴定图；M：DL2000DNA标样；泳道1是对照组Tar基因，大小为1662bp，泳道2是引物JC-TarR和JC-TarF进行PCR检测结果，与目的片段理论值2070bp接近；泳道3是引物JC-Tar-R和TYJC-tetRAF进行PCR扩增的片段，与目的片段理论值1469bp接近；泳道4是引物TYJC-tetRAR和JC-Tar-F进行PCR扩增的片段，与目的片段理论值576bp接近。图4在大肠杆菌基因组中相邻的两个基因CheB和CheR的位置示意图；图5用于CheB和CheR基因重组的PCR产物切胶回收电泳检测；M：DL2000DNA标样；1：四环素抗性基因胶回收产物。图6CheB和CheR基因敲除株菌落PCR鉴定图；M：DL2000DNA标样；泳道1是以MG1655原始菌株对照检测，大小为2029bp，泳道2、3、4是引物JC-CheRF和JC-CheBR进行PCR检测阳性克隆，大小为2070bp；泳道5为引物JC-CheBR和TYJC-tetRAF进行PCR检测MG1655原始菌株的对照组，没有条带，和预期相符；泳道6、7、8是引物JC-CheBR和TYJC-tetRAF进行PCR检测阳性克隆，大小为1469bp；泳道9为引物TYJC-tetRAR和JC-CheRF进行PCR检测MG1655原始菌株的对照组，没有条带，和预期相符；泳道10、11、12是引物TYJC-tetRAR和JC-CheRF进行PCR检测阳性克隆，大小为576bp。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。以下实施例中，从NCBI数据库获得tetRA基因序列，双下划线部分为tetRA基因的18bp的序列，用于四环素同源本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以四环素抗性基因

【技术特征摘要】
1.一种以四环素抗性基因tetRA为替换基因的λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的检测方法，其特征在于，包含如下步骤：（1）设计引物：从NCBI数据库获得tetRA基因序列和待敲除的基因H的序列，设计一对引物H-tetRAR和H-tetRAF用于扩增同源重组序列，每一条引物的5’端有35～60bp，分别为待敲除的基因H上下游同源序列a或a’片段，其序列长度均L1，3’端分别为四环素抗性基因tetRA两侧自带的引物序列b或b’片段，四环素抗性基因tetRA的序列长度为L；设计用于鉴定基因是否重组的鉴定引物JC-HF和JC-HR，其序列分别位于待敲除的基因H上下游同源序列a或a’片段的外侧的c或c’片段，引物JC-HF和JC-HR的序列长度均为L2；设计两条互补的通用引物TYJC-tetRAF和TYJC-tetRAR，通用引物的序列为四环素抗性基因tetRA内部的d片段，四环素抗性基因tetRA上从序列b至d之间的序列长度为L3，四环素抗性基因tetRA上从序列d’...

【专利技术属性】
技术研发人员：王松太，江楠，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42