一种新型核酸探针标记方法技术

本发明专利技术提供了一种DNA荧光探针的标记方法，包括：荧光探针5

【技术实现步骤摘要】
一种新型核酸探针标记方法


[0001]本专利技术涉及检测基因的新型探针和检测方法，特别涉及新型探针与普通探针在同一通道检测时的差别。

技术介绍

[0002]微滴数字PCR平台(Droplet digital PCR，ddPCR)是基于PCR技术的第三代检测方法，采用一种全新的方式对核酸分子进行绝对定量，与传统PCR、定量PCR相比，具有更高的精确度、准确度和灵敏性。ddPCR定量的结果不再依赖于Ct值，实现真正意义上的绝对定量。除应由上的巨大优势外，ddPCR有一定限制。由于检测过程使用双通道，ddPCR理论上每次可检测两个目标基因。
[0003]对肿瘤患者临床检测的金标准是使用从肿瘤组织中抽提的DNA进行检测。鉴于部分病人肿瘤组织很难获得，比如乳腺癌病人发现较晚不适合进行手术切除或组织活检，以及在治疗过程中需要多次取样进行病程监控，血液中的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是进行临床检测的重要样本来源。由于ctDNA在血液中含量极低，进行ddPCR检测受到很大限制。
[0004]另一方面，对于临床研究而言，病人样本极其珍贵，获得来源受限，同时病人样本的获取量必须符合相关规定，不足以满足目前大量科学研究的需要。因此，使用尽可能少的样本获得精确的检测结果，是很多科研项目能够顺利开展的前提。
[0005]因此，需要一种新型探针，可以快速、精确地检测多个目的基因拷贝数，并与普通探针能够区分。本专利技术的新型探针及其检测方法解决了该问题。

技术实现思路
r/>[0006]在本专利技术的一方面，提供了一种新型探针标记方法，包括：
[0007]a)荧光探针5
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端标记一个常规荧光基团、3
’
端标记一个相对应的淬灭基团；
[0008]b)在DNA探针序列前1/3到后1/3的中间序列，标记一个与5
’
端相同的荧光基团；和
[0009]c)说明书，所述说明书提供了PCR检测中每个单通道检测两个目的基因的方法，其中通过对样本进行PCR扩增，将所述新探针的检测信号和常规探针检测信号进行区分，计算目的基因拷贝数。
[0010]在本专利技术的一个实施例中，所述的新型探针检测还包括至少一种选自下组的试剂：
[0011]a)DNA聚合酶；
[0012]b)核苷酸单体混合物；和
[0013]c)能够扩增含有所述目的基因序列的一对引物或两对引物。
[0014]在本专利技术的一个实施例中，所述的新型探针能用于检测多个目的靶点的拷贝数。
[0015]在本专利技术的一个具体实施例中，目的靶点可能为同一基因的突变型位点和野生型位点，也可能为不同基因的不同位点。
[0016]在本专利技术的一个具体实施例中，所述PCR为数字PCR。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，如权利要求1所述的新探针，其中，第2个荧光基团标记范围为DNA探针序列前1/3到后1/3的中间序列。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，探针长度包括50bp以下、40bp以下、30bp以下、20bp以下，或10bp以下。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，所述5
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端标记荧光基团选自由FAM、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、r hodamine 6G(P6G)、tetramethyirhodamine(TMR)、tetramethylrhoda mine isothiocyanate(TMRITC)、x-rhodamine、Texas red、生物素、和亲和素所组成的组。
[0020]在本专利技术的一个具体实施例中，所述3
’
端标记淬灭基团选DDQ-I、DDQ-II、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、B HQ-1、BHQ-2、BHQ-3、"QSY7"“QSY-21”和"QSY33"(分子探针公司)、Ferrocene及其衍生物、methyl viologen、tetramethylrhod amine(TAMRA)、Minor groove binding non-fluorescent quencher(MGBNFQ)和N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium所组成的组。
[0021]在本专利技术的一个具体实施例中，所述5
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端标记荧光基团与所述3
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端标记淬灭基团相对应。
附图说明
[0022]图1示出PCR中普通探针的检测结果。其中1所表示的信号为CHANNEL1阳性，2所表示的信号为CHANNEL 2阳性，3所表示的为双阳性，4所表示的信号为双阴性。
[0023]图2示出新型探针和普通探针同时检测的结果。其中A、B信号为新探针的检测信号，C、D信号为普通探针的检测信号。新探针的信号荧光强度与普通探针相比有明显差异，可以用于区分同一检测通道内两个目的基因的拷贝数。橙色信号区域为相对应的双阳性区，灰色区域为阴性区。
具体实施方式
[0024]如本文所述，术语“基因”是指在本专利技术中是指编码蛋白的DNA序列，例如，但不限于，存在于细胞基因组中的编码蛋白的DNA序列。本专利技术的方法可以用于检测任何可能具有突变区域的基因或具有保守序列能够计算拷贝数的基因，例如但不限于，KRAS基因(NM_004985.4)，NRAS基因(NM_002524.4)，和BRAF基因(NM_004333.4)。
[0025]如本文所述，术语“突变区域”是指在基因中的一段连续的核苷酸序列，其中含有至少两个点突变位点，或者含有至少一个存在两种突变可能的点突变位点。在某些实施方式中，突变区域的长度不超过50bp、不超过40bp、不超过30bp、不超过20bp、或不超过10bp。当含有至少两个点突变位点时，突变区域可以是由两个点突变位点为起止端点而界定的一段区域，即突变区域的两个端点分别为两个点突变位点。例如，某基因的第30位碱基和第40位碱基可能存在点突变，因此该基因的突变区域可以是从第30位碱基开始到第40位碱基结束的、长度为11个碱基的一段连续的核苷酸序列。在某些实施方式中，在突变区域中可能存在至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个点突变位点。在这种情况下，在突变区域中，
除了两个端点以外的中间部份也具有至少一个点突变位点。在某些实施方式中，至少2个(或者至少3个、4个、5个、6个)点突变位点是紧邻的。例如，在某基因的第30位、31位、和32位碱基都可能存在点突变，因此第30、31和32位碱基是紧邻的点突变位点。
[0026]如本文所述，术语“点突变”是指从野生型碱基改变为另一个不同的碱基，即突变型碱基。“点突变位点”是指具有点突变可能的一个特定的碱基位置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新标记探针，包括：a)荧光探针5
’
端标记一个常规荧光基团、3
’
端标记一个相对应的淬灭基团；b)在DNA探针序列前1/3到后1/3的中间序列，标记一个与5
’
端相同的荧光基团；和c)说明书，所述说明书提供了PCR检测中每个单通道检测两个目的基因的方法，其中通过对样本进行PCR扩增，将所述新探针的检测信号和常规探针检测信号进行区分，计算目的基因拷贝数。2.如权利要求1所述的标记探针，其中，该探针能用于检测基因的点突变、拷贝数变异和表达水平。3.如权利要求1所述的标记探针，其中，所述PCR为数字PCR。4.如权利要求1所述的标记探针，其中，第2个荧光基团标记范围为DNA探针序列前1/3到后1/3的中间序列。5.如权利要求1所述的标记探针，其中，探针长度包括50bp以下、40bp以下、30bp以下、20bp以下，或10bp以下。6.如权利要求1所述的标记探针，其中，所述5
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端标记荧光基团选自由FAM、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texa...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭兴中，陈文，方剑秋，
申请(专利权)人：杭州丹威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：