一种Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法。该方法包括如下步骤：S1、免疫磁珠的制备：将Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒三种抗体分别偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠；S2、病毒的富集：将Ⅰ型副流感病毒阳性或Ⅲ型副流感病毒阳性或呼腺病毒阳性的样本保存液，与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵育；S3、用磁性工具分离免疫磁珠

【技术实现步骤摘要】
一种I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法。

技术介绍

[0002]WHO数据显示，呼吸道感染是全球第四大致死原因，是中国5岁以下儿童的第三大死因。流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和人冠状病毒是引起成人急性呼吸道感染的主要病原体。2021年3月1日，国家卫健委医管局印发《2021年国家医疗质量安全改进目标》，针对当前医疗质量安全领域突出或者共同存在的薄弱环节和关键领域，提出了33项改进目标。其中第六项指出，呼吸道感染病原谱复杂，部分可引起流行，应提高呼吸道病原体核酸检测率。其中流感病毒和呼吸道合胞病毒是婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者重症下呼吸道感染及其死亡的首要致病原。
[0003]人副流感病毒(human parainfluenza virus，HPIV)为无节段单负链RNA病毒，全长约15 000个核苷酸，属副黏病毒科，HPIVs分为HPIV1
‑
4四个血清型，其中HPIV
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4又分为HPIV
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4A和HPIV
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4B两种亚型，HPIV
‑
1和HPIV
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3为呼吸道病毒属(respirovims)，HPIV
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2和HPIV
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4为腮腺炎病毒(mbulavirus)。HPIVs是继呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)后引起儿童急性呼吸道感染的又一常见病毒，有研究显示，人副流感病毒引起的急性呼吸道疾病在儿童呼吸道患者中可高达40％，会引起哮喘，毛细支气管炎，肺炎等较严重的临床症状。此外，人副流感病毒在老年人和免疫功能不全人群中也会引起严重的下呼吸道疾病。
[0004]腺病毒属于双链DNA病毒，可长期存在于人群中，造成急性发热性呼吸道感染的大规模流行。目前已发现的腺病毒包括7个亚群(A
‑
G)，67个型别，其中对人类具有致病性的有55个血清型，可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等，并引起广泛的临床症状，但呼吸道腺病毒更为常见，其中可导致呼吸道感染的腺病毒包括腺病毒3型、7型、11型、14型、21型、55型等，3型、7型、55型在我国较为常见。腺病毒感染临床症状主要为发热、咽部充血、咽痛、咳嗽、身体酸痛乏力较多，少数患者可有腹泻、腹痛等胃肠道症状。
[0005]目前临床检验中应用的针对副流感和腺病毒病毒的方法主要是多种病毒核酸联合检测方法，大多包含是6种及以上病毒检测，如呼吸道病毒核酸六重联检试剂盒(PCR荧光探针法)等，项目的收费比较高。但目前所应用的荧光PCR检测方法，作为一种酶促反应，仍然存在样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、PCR检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点，另外在血筛等临床检验中现有的检测方法也无法满足其灵敏度的要求；以上的不足导致目前针对副流感和腺病毒的荧光PCR检测方法在临床检验中的应用受到了限制，尤其无法满足门诊和急诊的需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法，以解决现有检测技术中存在的样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、PCR检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点。
[0007]基于上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]一种用于I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重荧光PCR检测的引物探针组合物，该组合物包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，具体是(表1)：
[0009]表1
[0010][0011][0012]一种用于I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重荧光PCR检测的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物探针组合物。
[0013]一种I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法，该方法用于非疾病诊断目的，该方法包括如下步骤：
[0014]S1、免疫磁珠的制备：将I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒三种抗体分别偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠；
[0015]S2、病毒的富集：将I型副流感病毒阳性或III型副流感病毒阳性或呼腺病毒阳性的样本保存液，与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵育，得到免疫磁珠
‑
病毒复合物；
[0016]S3、用磁性工具分离免疫磁珠
‑
病毒复合物，将免疫磁珠
‑
病毒复合物重悬于TE缓冲液中加热裂解；
[0017]S4、用磁性工具分离磁珠，得到富集浓缩的病毒，用多重荧光PCR试剂对裂解产物中的液体直接进行检测；该多重荧光PCR试剂包含本专利技术所述的引物探针组合物。
[0018]本专利技术检测方法主要过程是：将呼吸道样本与分别偶联有I型副流感病毒抗体、III型副流感病毒抗体、腺病毒抗体的免疫磁珠混合，一定温度下混合孵育，使用磁性工具分离免疫磁珠
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病毒复合物，将复合物重悬于盐离子缓冲液中，将重悬的免疫磁珠
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病毒复合物进行加热裂解，使用磁性工具分离磁珠，对裂解产物(液体部分)使用荧光PCR检测试剂直接进行检测。使用多重荧光PCR技术，在同一检测孔中加入10个引物探针，包含3个荧光通道，可检测I型副流感病毒、III型副流感病毒、腺病毒3型、腺病毒7型和腺病毒55型。在检测的同时可区分I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒病毒，有利于精准判断病情，辅助疾病早期的诊断和治疗。
[0019]作为优选，步骤S4所述荧光PCR试剂(20μL)包含以下组分：如SEQ ID No：1至SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μM；如SEQ ID No：3至SEQ ID No：5所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.3μM；如SEQ ID No：6所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.13μM；如SEQ ID No：7至SEQ ID No：9所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.3μM；如SEQ ID No：10所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μM；如SEQ ID No：11至SEQ ID No：13所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μM。
[0020]作为优选，步骤S4所述荧光PCR试剂(20μL)包含以下组分：DNA聚合酶及逆转录酶混合液2μL/份，5
×
Reaction Buffer(含镁离子及dNTP)6μL/份，即终浓度1
×
。
[0021]本专利技术所述的荧光PCR检测试剂中含有耐抑制抗干扰的PCR反应缓冲液和快速扩增的DNA聚合酶，能对含有各种干扰物质的样本进行有效扩增和荧光检测。
[0022]作为优选，步骤S1所述I型副流感、III型副流感和腺病毒三种抗体均为单克隆病毒表面抗体。
[0023]作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重荧光PCR检测的引物探针组合物，其特征在于该组合物包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，具体是：2.一种用于I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重荧光PCR检测的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物探针组合物。3.一种I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法，该方法用于非疾病诊断目的，其特征在于该方法包括如下步骤：S1、免疫磁珠的制备：将I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒三种抗体分别偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠；S2、病毒的富集：将I型副流感病毒阳性或III型副流感病毒阳性或呼腺病毒阳性的样本保存液，与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵育，得到免疫磁珠
‑
病毒复合物；S3、用磁性工具分离免疫磁珠
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病毒复合物，将免疫磁珠
‑
病毒复合物重悬于TE缓冲液中加热裂解；S4、用磁性工具分离磁珠，得到富集浓缩的病毒，用多重荧光PCR试剂对裂解产物中的液体直接进行检测；该多重荧光PCR试剂包含权利要求1所述的引物探针组合物。4.根据权利要求3所述的多重富集检测方法，其特征在于：步骤S4所述荧光PCR试剂(20μL)包含以下组分：如SEQ ID No：1至SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μM；如SEQ ID No：3至SEQ ID No：5所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.3μM；如SEQ ID No：6所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.13μM；如SEQ ID No：7至SEQ ID No：9所示的核苷酸序列
的引物，终浓度0.3μM；如SEQ ID No：10所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶晔琪，曹玉婷，张苗雷，郭兴中，陈文，朱小娟，
申请(专利权)人：杭州丹威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：