一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法技术

本发明专利技术涉及植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法。包括以下步骤：步骤1.根据番茄黄化曲叶病毒基因组序列设计引物C4

【技术实现步骤摘要】
一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法


[0001]本专利技术涉及植物病毒检测
，尤其涉及探测一种DNA病毒
‑
一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

技术介绍

[0002]番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是一种单链环状DNA病毒，属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)以循环持久的方式传播TYLCV。TYLCV是单基因组，单链环状DNA病毒，基因组大小在2.8kb左右，编码6个开放式阅读框(open reading frames,ORFs)，即6个蛋白，V1和V2由正义链编码，C1
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C4由负义链编码。TYLCV侵染寄主后，ssDNA基因组在一系列细胞因子的参与下在细胞核内被转换成dsDNA，dsDNA然后从IR启动子开始双向转录，产生病毒mRNAs，据此可知TYLCV病毒mRNAs在侵染早期就已经产生。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.根据番茄黄化曲叶病毒基因组序列设计引物C4
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F和C4
‑
R；通过PCR法制备带地高辛标记的番茄黄化曲叶病毒特异性DNA探针；S2.提取感染番茄黄化曲叶病毒3天后的烟草总RNA；在琼脂糖胶上的分离总RNA；S3.采用虹吸法转移S2中分离的总RNA至带正电的尼龙膜；转膜结束后在紫外交联仪下固定膜上的总RNA；S4.预杂交，并使用步骤S1中制备的特异性DNA探针进行杂交；S5.洗涤杂交膜；进行杂交信号检测。2.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，所述C4
‑
F引物序列为：5
’‑
ATGGGGAACCACATCTCC
‑3’
；所述C4
‑
R引物序列为：5
’‑
TTAATATATTGAGGGCCTCGG
‑3’
。3.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，所述S2中，提取感染番茄黄化曲叶病毒3天后的烟草总RNA，包括以下步骤：用液氮迅速研磨烟草组织成细粉状；在1.5ml Eppendorf管中加入0.05～0.10g研磨后的粉末，加入1ml Trizol提取缓冲液，室温混匀后加入200μl氯仿，剧烈振荡后于室温静置5min；于4℃、12000r/min条件下，离心15min；吸上清液至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，于4℃沉淀1h；于4℃、12000r/min条件下，离心15min；舍弃上清液，进行瞬时离心，用枪头吸尽残留液体，加入700μl75％预冷乙醇洗涤沉淀，用枪头吸打沉淀；于4℃、5000r/min条件下，离心5min，弃乙醇后重复一次；将超净工作台上吹干，加入50μlDEPC处理的去离子水，于
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20℃保存备用。4.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，所述S2中，在琼脂糖胶上的分离总RNA，包括以下步骤：S21.制备1.0％(w/v)琼脂糖凝胶：将1.2g琼脂糖和11ml 10
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MOPS+99ml DEPC处理去离子水，获得混合液，将该混合液微波炉加热熔解琼脂糖后置于通风厨冷却至50
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60℃；加入10ml 37％甲醛以及适量10mg/ml溴化乙锭，混匀后倒胶；S22.将4倍体积的总RNA与1倍体积的5
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RNA loading buffer混匀后，65℃水浴变性10min后，冰浴3
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5min，瞬时离心后点样；S23.点样后，以5
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7V/cm的电压在1
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【专利技术属性】
技术研发人员：马小方，皮特，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院果树茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：