【技术实现步骤摘要】
一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法
[0001]本专利技术涉及基因测序领域，本专利技术涉及适用于一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法。
技术介绍
[0002]单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等多组学进行高通量测序分析的新技术。改技术的应用使得解释单个细胞的基因结构和基因表达状态，解读细胞间的异质性成为了可能。单细胞测序以备广泛可应用于发育生物学、免疫、肿瘤等方向的研究，并且涌现出大量高质量的研究和科研成果。其中单细胞全基因组测序通过对肿瘤组织中解离后得到的单个细胞的DNA进行全基因组扩增，再进行文库构建及测序，分析每个细胞中的基因情况，研究肿瘤发生发展机制、分子分型等，为肿瘤分型、肿瘤治疗策略、新药研发等提供新的方向。
[0003]单细胞测序对样本活性要求较高。人肿瘤组织多坏死病灶，不易获得高活率单细胞悬液，而且单细胞悬液运输过程中无法保证细胞活率。目前的实现方法是携带单细胞分离设备至医院，手术切下的新鲜离体组织立即进行消化及后续的分离处理，使该实验在成本、时间、地点...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提取细胞核的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：1)在二号缓冲液(LB)中进行样品机械裂解处理，经过冰置处理和吹打处理后获得裂解产物；2)将所述裂解产物进行第一过滤处理及第一离心处理，获得第一离心细胞核沉淀；3)将所述第一离心细胞核沉淀并在第一缓冲液(WB)中进行及冲洗第一重悬处理和第二过滤处理，然后进行第二次离心处理，获得第二离心细胞核沉淀；4)将所述第二离心细胞核沉淀在三号(NB)缓冲液中进行第二重悬混匀处理后进行第三过滤处理，获得的细胞核悬液，所述细胞核悬液在单细胞全基因组测序和扩增均一性检测前，进一步将细胞核进行重悬处理，经过重悬处理后，所述细胞核的浓度为1000核/μL；其中，所述样品为离体样本；所述一号缓冲液(WB)包括：10-20mM Tris-HCl(pH 7.5-7.8)，10-20mM NaCl，50-100mM KCl，2-10mM MgCl2，5-15mM CaCl2，0.04％BSA，1mg/mL PI以及0.2U/μL RNase抑制剂；所述样品与所述一号缓冲液(WB)的质量体积比为5mg:0.5mL；所述二号缓冲液(LB)为一号缓冲液(WB)含0.2％NP-40(质量体积比)；所述三号缓冲液(NB)为含1％FBS，1mM DTT的D-Hanks缓冲液；使用前，所述一号缓冲液(WB)，所述二号缓冲液(LB)以及所述三号缓冲液(NB)预先经过4℃预冷处理；步骤1)中破碎处理后的所述样品体积≤0.2mm3；步骤1)中所述冰置处理时间为8-10min并利用移液枪混匀，步骤1)中所述吹打处理为10-15次；步骤2)中所述第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min；步骤3)中第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行；步骤4)中第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行。2.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤1)中使用研磨杵进行所述机械裂解处理。3.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤2)中所述第一过滤处理是通过直径为70μm的细胞过滤器进行。4.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤2)中所述第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min。5.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤3)中所述第一重悬处理中一号缓冲液(WB)的用量为0.5mL。6.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤4)中所述第二离心细胞核沉淀在0.2mL的所述三号缓冲液(NB)进行所述第二重悬混匀处理。7.一种提取离体冰冻肿瘤组织的细胞核的方法，基于所述权利要求1所述的提取细胞核的方法，所述提取离体冰冻肿瘤组织的细胞核的方法包括：步骤A1，所述第二缓冲液预先经过4℃预冷处理，将所述离体冰冻肿瘤组织在所述第二缓冲液(LB)中进行机械破碎处理，所述离体冰冻肿瘤组织与所述第二缓冲液的质量体积比为不超过5mg:0.5mL，机械破碎处理后的所述离体冰冻肿瘤组织体积≤0.2mm3，将机械破碎处理产物冰置处理5～10min，利用移液枪混匀；然后将冰置处理产物进行10～15次吹打处
理，获得吹打处理产物；步骤A2，将步骤A1获得的所述吹打处理产物进行第一过滤处理，第一过滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，何牮，孟梅，刘宁宁，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：
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