扩增子长度的测量方法技术

本发明专利技术提供一种扩增子长度的测量方法，包括以下步骤。在反应孔中加入qPCR混合试剂、前置引子、反置引子、杂交探针、双股DNA结合染料及核酸样品，以进行qPCR反应，分别测得杂交探针及双股DNA结合染料随着反应循环数变化的荧光强度。接着，进行运算方法，以计算出扩增子的长度，本发明专利技术提供的扩增子长度的测量方法，能够同时精确地分析核酸样品中扩增子的长度及含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是有关于一种测量方法，且特别是有关于一种扩增子长度的测量方法。
技术介绍
在分子生物学领域，需要对核酸标靶(例如：DNA或RNA)进行基因定序，将核酸标靶以正确的碱基排列作串列表示，进而通过传递遗传信息的基因序列以研究具体样品。基因定序的发展加速生物学与医学的研究与发现，并且广泛地应用于生物诊断、生物科技、鉴定科学和生物系统学领域中。近年来，已发展出次世代定序(NextGenerationSequencing，简称NGS)技术，此高效率定序技术可大幅降低定序所需的成本和时间。次世代定序检测需先建立数据库(library)，包括利用两端已知序列的转接子(adaptor)，接上核酸模板片段，此接合物即为次世代定序数据库。在进行次世代定序检测之前，必须先确认其数据库品质，若次世代定序数据库含量过高，则群集密度(clusterdensity)过高，可能导致检测实验数据品质不佳。反之，若次世代定序数据库含量过低，则群集密度过低，可能导致低产率(yield)。另外，若次世代定序数据库中的长度分布过广，则可能导致读取深度(readdepth)过低。因此，在次世代定序技术的操作过程中，在上机步骤之前，须进行品质管控(qualitycontrol)以确认次世代定序数据库的长度及含量。目前，大多通过qPCR(quantitativepolymerase-chain-reaction，定量即时聚合酶链锁反应，亦称Real-timePCR)技术确认次世代定序数据库的含量，并通过毛细管电泳法(capillaryelectrophoresis，简称CE)确认次世代定序数据库的长度。然而，qPCR技术需制作标准曲线，实验程序上较为复杂，而毛细管电泳法则具有低敏感度与非特异性反应等缺点。再者，须分别以两种不同实验确认次世代定序数据库的长度及含量，也导致实验所需的成本和时间增加。因此，开发一种能够同时精确地分析次世代定序数据库的长度及含量的测量方法，为本领域技术人员亟欲发展的目标。
技术实现思路
本专利技术提供一种扩增子长度的测量方法，能够同时精确地分析核酸样品中扩增子的长度及含量。更具体而言，以qPCR技术来检测次世代定序数据库的含量时，次世代定序数据库放大后的核酸产物即为扩增子，本专利技术是通过检测扩增子的长度及含量以进一步计算次世代定序数据库的长度及含量。本专利技术提出一种扩增子长度的测量方法，包括以下步骤。首先，将qPCR混合试剂(mastermix)、前置引子(forwardprimer)、反置引子(reverseprimer)、杂交探针(hybridizationprobe)、双股DNA结合染料(doublestrandedDNAdye)及极端稀释(3copies/μl至30copies/μl)的核酸样品混合，以形成qPCR反应混合液。接着，将此qPCR反应混合液分配于测试载片的反应孔中，每一反应孔中至多可分配到一个以下的核酸样品。之后，对qPCR反应混合液进行qPCR反应，分别测得核酸样品中的每一扩增子的杂交探针及双股DNA结合染料随着反应循环数变化的荧光强度。接着，进行运算方法，以计算出每一扩增子的长度。在本专利技术的一实施例中，运算方法包括在每一扩增子所测得的杂交探针的荧光强度中定出临界值(thresholdvalue)，并对应得出当杂交探针的荧光强度为临界值时，每一扩增子的临界反应循环数(thresholdcycle)。之后，对应得出在临界反应循环数时，每一扩增子的双股DNA结合染料的个别荧光强度。将个别荧光强度代入双股DNA结合染料的荧光强度及扩增子长度的线性回归曲线，以计算出每一扩增子的长度。在本专利技术的一实施例中，运算方法包括针对每一扩增子所测得的双股DNA结合染料的荧光强度及杂交探针的荧光强度，分别换算成双股DNA结合染料的正规化荧光强度及所杂交探针的正规化荧光强度。之后，将每一扩增子的双股DNA结合染料的正规化荧光强度及杂交探针的正规化荧光强度相除，以取得荧光强度比值。接着，将临界反应循环数时每一扩增子的荧光强度比值代入荧光强度比值及扩增子长度的线性回归曲线，以计算出每一扩增子的长度。在本专利技术的一实施例中，双股DNA结合染料的正规化荧光强度及杂交探针的正规化荧光强度的换算方法，包括将每一反应循环时的双股DNA结合染料的荧光强度除以反应循环区间内双股DNA结合染料的平均荧光强度，以换算出双股DNA结合染料的正规化荧光强度。将每一反应循环时的杂交探针的荧光强度除以反应循环区间内杂交探针的平均荧光强度，以换算出杂交探针的正规化荧光强度。在本专利技术的一实施例中，双股DNA结合染料包括SYBRgreen染料、Evagreen染料、LCgreen染料或SYTO9染料。在本专利技术的一实施例中，临界值为1.1至1.5。在本专利技术的一实施例中，qPCR混合试剂包括反应缓冲液、dNTP、MgCl2及Taq聚合酶。在本专利技术的一实施例中，双股DNA结合染料在qPCR反应混合液中的浓度为1uM至10uM。在本专利技术的一实施例中，杂交探针在qPCR反应混合液中的浓度为0.2uM至1uM。在本专利技术的一实施例中，前置引子在qPCR反应混合液中的浓度为0.03uM至0.5uM，所述反置引子在qPCR反应混合液中的浓度为0.03uM至0.5uM。在本专利技术的一实施例中，核酸样品与qPCR反应混合液的体积比为1:60至1:10。在本专利技术的一实施例中，杂交探针包括TaqMan探针、分子信号(MolecularBeacon)探针、双杂交探针(DualHybridizationProbes)或Eclipse探针。在本专利技术的一实施例中，核酸样品包括次世代定序数据库。基于上述，本专利技术所提出的扩增子长度的测量方法，通过同时将杂交探针(与扩增子的含量相关)及双股DNA结合染料(与扩增子的长度相关)加入qPCR反应混合液进行qPCR反应，分别测得杂交探针及双股DNA结合染料随着反应循环数变化的荧光强度，对应得出扩增子的临界反应循环数，进而计算出扩增子的长度。因此，本专利技术所提出的扩增子长度的测量方法能够同时精确地分析核酸样品中扩增子的长度及含量，并应用于次世代定序技术的品质管控。为让本专利技术的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。附图说明图1为本专利技术一实施例的扩增子长度的测量方法的流程示意图；图2为本专利技术一实施例的扩增子长度的测量方法中，所测得的杂交探针及双股DNA结合染料随着反应循环数变化的荧光强度曲线图；图3为本专利技术另一实施例的扩增子长度的测量方法的流程示意图；图4为本专利技术另一实施例的扩增子长度的测量方法中，所测得的正规化EvaGreen荧光强度及正规化TaqMan荧光强度的荧光强度比值随着反应循环数变化的曲线图；图5为本专利技术一实施例的扩增子长度的测量方法所执行的实验例，所测得的TaqMan探针及Evagreen染料随着反应循环数变化的荧光强度曲线图；图6为本专利技术一实施例的扩增子长度的测量方法所执行的实验例中，不同长度的扩增子的正规化Evagreen染料荧光强度的直方图；图7为本专利技术一实施例的扩增子长度的测量方法所执行的实验例中，正规化Evagreen染料荧光强度与扩增子长度的曲线图。具体实施方式图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增子长度的测量方法，其特征在于，包括：将qPCR混合试剂、前置引子、反置引子、杂交探针、双股DNA结合染料及核酸样品混合，以形成qPCR反应混合液；将所述qPCR反应混合液分配于测试载片的反应孔中，每一所述反应孔至多可分配到一个以下的所述核酸样品；对所述qPCR反应混合液进行qPCR反应，分别测得所述核酸样品中的每一扩增子的所述杂交探针及所述双股DNA结合染料随着反应循环数变化的荧光强度；以及进行运算方法，以计算出每一所述扩增子的长度。

【技术特征摘要】
2015.08.24 TW 1041274291.一种扩增子长度的测量方法，其特征在于，包括：将qPCR混合试剂、前置引子、反置引子、杂交探针、双股DNA结合染料及核酸样品混合，以形成qPCR反应混合液；将所述qPCR反应混合液分配于测试载片的反应孔中，每一所述反应孔至多可分配到一个以下的所述核酸样品；对所述qPCR反应混合液进行qPCR反应，分别测得所述核酸样品中的每一扩增子的所述杂交探针及所述双股DNA结合染料随着反应循环数变化的荧光强度；以及进行运算方法，以计算出每一所述扩增子的长度。2.根据权利要求1所述的扩增子长度的测量方法，其特征在于，所述运算方法包括：在每一所述扩增子所测得的所述杂交探针的荧光强度中定出临界值，并对应得出当所述杂交探针的荧光强度为所述临界值时，每一所述扩增子的临界反应循环数；对应得出在所述临界反应循环数时，每一所述扩增子的所述双股DNA结合染料的个别荧光强度；以及将所述个别荧光强度代入所述双股DNA结合染料的荧光强度及扩增子长度的线性回归曲线，以计算出每一所述扩增子的长度。3.根据权利要求2所述的扩增子长度的测量方法，其特征在于，所述临界值为1.1至1.5。4.根据权利要求1所述的扩增子长度的测量方法，其特征在于，所述运算方法包括：针对每一所述扩增子所测得的所述双股DNA结合染料的荧光强度及所述杂交探针的荧光强度，分别换算成所述双股DNA结合染料的正规化荧光强度及所述杂交探针的正规化荧光强度；将每一所述扩增子的所述双股DNA结合染料的正规化荧光强度及所述杂交探针的正规化荧光强度相除，以取得荧光强度比值；以及将临界反应循环数时每一所述扩增子的所述荧光强度比值代入所述荧光强度比值及扩增子长度的线性回归曲线，以计算出每一所述扩增子的长度。5.根据权利要求4所述的扩增子长度的测量方法，其特征在于，所述双股DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱创汎，味正唯，张钰，黄章维，
申请(专利权)人：奎克生技光电股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71