一种单管一步三引物反转录聚合酶链反应方法技术

一种单管一步三引物反转录聚合酶链式反应方法，其ＲＴ－ＰＣＲ反应液含一对ＰＣＲ引物和一个位置在ＰＣＲ反引物下游的反转录引物，ＰＣＲ引物被包埋在石蜡等固体颗粒内置于反应液中，反转录时不与反应液接触，进入扩增阶段石蜡熔化引物被释放到溶液中。同时通过设计ＰＣＲ引物的解链温度大于反转录引物的解链温度、目标扩增产物的解链温度低于由ＰＣＲ正引物与反转录引物形成的非目标扩增产物的解链温度、或设计反转录引物位置距ＰＣＲ反引物较远等方法避免反转录引物对扩增的干扰。适用于终点法直接荧光或闭管直接荧光方法进行高速度、高通量的ＲＮＡ检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学技术，特别是涉及反转录聚合酶链式反应的方法。
技术介绍
反转录聚合酶链反应(RT-PCR)是以RNA为原始模板的聚合酶链反应，在分子生物学研究和临床诊断上有广泛的应用。近年来发展的单管一步RT-PCR技术操作简单，比以随机引物组、Oligo(dT)引物或基因专一引物进行反转录得到cDNA，再进行扩增的二步法更适合高通量检测的需求。但是现行单管一步RT-PCR方法扩增所用的反引物同时用作反转录引物，加之反转录步驟的温度较低容易产生非专一扩增产物。如在PCR反引物的下游另选一个基因专一的反转录引物就能像嵌套式PCR一样提高扩增的专一性。但是这种方法又均需要将反转录和扩增分二步来完成不适合高通量检测的需要。至今尚無采用三个引物又单管一步完成的反转录PCR的報導。本發明應用石蠟將PCR引物和反轉錄引物分開，通過PCR引物和反轉錄引物的設計選擇及控制循環的變性或退火溫度實現了單管一步三引物反轉錄PCR。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题本专利技术所要解决的技术问题是提供一种專一的、含三個引物的单管一步反转录聚合酶链式反应方法。一個基因專一的反转录引物和一對扩增用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单管一步三引物反转录聚合酶链式反应方法，反应液组成包含反转录酶、耐热ＤＮＡ聚合酶、一个基因專一反转录引物和一对在反轉錄引物上游的ＰＣＲ引物，反应依次包括如下步骤：（１）由ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ；（２）ＤＮＡ模板变性解链 ；（３）引物与模板退火；（４）在ＤＮＡ聚合酶催化下延伸合成互补ＤＮＡ链；（５）按步骤（２）－（４）循环进行扩增反应；其特征在于一对ＰＣＲ引物在反轉錄步驟用融点为６５－８５℃的水不溶惰性固体與反应液分開。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐定邦，朱德芬，谢文凯，陈有容，
申请(专利权)人：徐定邦，徐文慧，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]