桔梗皂苷D在制备抑制肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了桔梗皂苷D在制备抑制肿瘤药物中的应用。本发明专利技术的优点在于在其制备的抑制肿瘤的药物可以更好的治疗肿瘤患者，并能减少患者的不良反应，为最终治愈肿瘤患者奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学领域，具体涉及桔梗皂苷D在制备抑制肿瘤药物中的应用。
技术介绍
骨肉瘤是较常见的发生在20岁以下的青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约为小儿肿瘤的5％。目前对骨肉瘤的主要治疗方法是手术加术后化疗，但是化疗药物往往具有很强的副作用，同时还破坏人体的免疫系统。所以一种副作用较小的药品，不但能够抗包括骨肉瘤在内的肿瘤还能使患者减少痛苦是十分具有实用价值的。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了桔梗皂苷的应用，其特征在于为其在制备抑制肿瘤药物中的应用。较佳地，所述的抑制肿瘤药物为抑制骨肉瘤药物。本专利技术的优点在于在其制备的抑制肿瘤的药物可以更好的治疗肿瘤患者，并能减少患者的不良反应，为最终治愈肿瘤患者奠定了基础。附图说明：图1为本专利技术实施例中桔梗皂苷D对骨肉瘤细胞和对人成骨细胞hFOB的作用的对比图；图2是本专利技术实施例中桔梗皂苷D作用后骨肉瘤细胞凋亡的情况图。图3为本专利技术实施例中小鼠的活体成像图及实验结果图。具体实施方式桔梗皂苷D是从桔梗科植物的根部提取的一种三萜类化合物，它本是一种广泛应用于呼吸系统疾病的中药制剂。下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步地说明，以更好地理解本专利技术。实施例1：桔梗皂苷D对骨肉瘤细胞和人成骨细胞hFOB细胞活力的影响的实施步骤。体外培养骨肉瘤细胞系Saos2-lung，它是从荷瘤裸鼠肺转移灶分离的高转移潜能骨肉瘤细胞亚群，并且具有荧光素酶标记，母本细胞为最常见的Saos2骨肉瘤细胞。同时培养hFOB细胞。取对数期生长的Saos2-lung和hFOB细胞，用胰酶消化后，以300g离心5min。离心后去除上清，用完全培养基重悬细胞，并各自计数。将两种细胞以5000个/孔的数量种到96孔板中。细胞种板后次日加入相应浓度的桔梗皂苷D，桔梗皂苷D的浓度分别为0,5,10和20μM。每个浓度三个复孔，检测时间点为0h，24h，48h和72h。细胞活力检测用CCK-8检测试剂盒。首先以1:10的比例用DMEM完全培养基配置适量的CCK-8溶液，将加药后的Saos2-lung和hFOB细胞各取一板，把细胞中的培养液换上刚配置的CCK-8溶液，110μl/孔。放在培养箱中孵育2.5h。2.5h后将加入CCK-8的细胞取出，除掉孔中气泡，放入酶标仪中测量450nm的吸光度值。依次检测0h，24h，48h和72h后骨肉瘤的细胞活力。细胞活力计算公式为：(24h/48h/72h处理组吸光度—0h处理组吸光度)/(24h/48h/72h非处理组吸光度—0h非处理组吸光度)。结果如图1所示，图1A是桔梗皂苷D对Saos2-lung骨肉瘤细胞的细胞活力的影响，可以看到桔梗皂苷D能够抑制骨肉瘤细胞的活性，并且呈浓度依赖性和时间依赖性。图1B中是桔梗皂苷D对人成骨细胞hFOB的细胞活力的影响，如图1B所示桔梗皂苷D对人成骨细胞hFOB无毒性作用。因此，桔梗皂苷D可以抑制骨肉瘤细胞同时对正常细胞并无毒性作用，说明其副作用小，对患者没有不良反应。实施例2：桔梗皂苷D对骨肉瘤细胞凋亡的影响的实施步骤。1.凋亡诱导取对数期生长的Saos2-lung细胞，消化后离心。离心后去除上清，用DMEM完全培养基重悬细胞并计数。将细胞以2×105个/孔的数量种到6孔板中，细胞分三组，桔梗皂苷D的浓度分别为0，10和20μM，每组设三个复孔。待细胞贴壁后加桔梗皂苷D诱导凋亡，凋亡诱导在无血清培养基中进行。2.凋亡检测按照细胞传代方法收集细胞，胰酶需用不含EDTA的胰酶。将细胞悬液收集到流式管中。1500rpm离心5min后小心去掉流式管中培养基，加入预冷的PBS缓冲液洗涤细胞，并再次以1500rpm离心5min。小心倒掉流式管中上清，按AlexaAnnexinⅤ/PI试剂盒说明加入100μl1×结合缓冲液(bindingbuffer)和5μlAlexaannexinⅤ染色液混匀，室温孵育15min；最后加入1μl100μg/ml的PI工作染色液，再加入400μl1×结合缓冲液(bindingbuffer)，并将流式管置于冰上。用流式细胞仪检测细胞结合AnnexinⅤ和PI的情况。图2为最终的结果，图2A是不同浓度桔梗皂苷D对骨肉瘤细胞凋亡的流式细胞检测结果。针对图2A，在图2B中对凋亡细胞比例进行了统计，如图所示，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例随桔梗皂苷D浓度的增加而增多，并且具有统计学意义。由此可见，桔梗皂苷D能够诱导骨肉瘤凋亡，并且呈浓度依赖性。实施例3：桔梗皂苷D在体内对骨肉瘤生长和转移的影响的实施步骤。1.骨肉瘤模型建立取对数期生长的Saos2-lung骨肉瘤细胞，随后将此种细胞消化离心，用PBS溶液重悬骨肉瘤细胞并用细胞计数仪计数，用台盼蓝染色观察细胞的活力，然后再次离心沉淀细胞。采用PBS溶液再次重悬细胞，使细胞浓度至少为2×108/ml。随后采用SPF级4周龄裸鼠(BALB/c-nu/nu)建立骨肉瘤胫骨原位模型，共20只，每组5只，共4组。动物的饲养和操作均按照上海交通大学医学院动物伦理委员会的要求执行。应用3.5％戊巴比妥钠麻醉，每只裸鼠腹腔注射100μl。将骨肉瘤细胞混合均匀，然后用1ml注射器抽取细胞悬液。待动物麻醉之后，将裸鼠仰卧位，左手拇示指捏住裸鼠的右膝关节并将其屈曲呈90°，用75％酒精棉球擦拭消毒之后，右手持1ml注射器从右膝关节胫骨平台处垂直进针，用来回旋转的方式轻轻地将针头钻入骨皮质，当获得突破感后即可认为到达骨髓腔，随后将50μl细胞悬液注射入裸鼠胫骨近端骨髓腔中，边退针头边注射，注射后用75％酒精棉球擦拭。用此方法，每只裸鼠的骨髓腔内注射了大约1×107个骨肉瘤细胞。2.动物分组及药物治疗待模型建立完成后，20只裸鼠被随机分为4组，分别为非治疗组，桔梗皂苷D低剂量组，桔梗皂苷D高剂量组以及顺铂阳性对照组。当肿瘤体积达到100mm3时，桔梗皂苷D低剂量组和高剂量组分别给予5mg/kg和10mg/kg桔梗皂苷D治疗，每天腹腔注射一次。顺铂治疗组剂量为15mg/kg，每周腹腔注射两次。非治疗组用生理盐水腹腔注射，每周注射两次。按照此种治疗方案连续治疗四周。再测试小鼠体内的骨肉瘤细胞，发现结果如图2所示，桔梗皂苷D能够促进骨肉瘤细胞的凋亡。3.动物活体成像检测Saos2-lung细胞带有荧光素酶标记，因此可对动物模型进行在体荧光信号检测，。检测前需要给予裸鼠萤火虫荧光素酶底物注射。萤火虫荧光素酶底物浓度为15mg/ml。每只裸鼠按照150mg/kg体重的剂量给药。发光检测前按上述剂量腹腔注射底物，7至8min后将裸鼠用异氟烷气体麻醉，然后转入Xenogen公司的IVIS200小动物活体成像仪中，采用维持麻醉浓度，bin值为4，曝光时间为5s，记录荧光图像，并计算感兴趣区域(ROI)每cm2、每秒的光子数(photons/sec/cm2)，后续各组之间的荧光强度比较即为此指标。动物成像每周一次，连续监测四周。最终结果如图3所示，图3A是经过桔梗皂苷D和顺铂治疗后的骨肉瘤的大体标本，图3B是对图3A的统计学结果，可以看到，高浓度的桔梗皂苷D能够产生与顺铂相当的抑制肿瘤生长的效果，并且与对照组具有统计学意义。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
桔梗皂苷D的应用，其特征在于，其在制备抑制肿瘤药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.桔梗皂苷D的应用，其特征在于，其在制备抑制肿瘤药物中的应用。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤亭亭，韩修国，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31