本发明专利技术公开了miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ ID NO.1所示。通过研究发现，miRNA-9在高转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著低于不具有转移能力的小鼠肝癌细胞，同时本发明专利技术还发现上调miRNA-9后小鼠肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和黏附能力均减弱。因此认为，miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞的转移，降低小鼠肝癌细胞的恶性程度。针对具有转移能力的小鼠肝癌细胞，将miRNA-9或其类似物miRNA-9的mimic制备成抑制肿瘤转移的药物，或也可以构建miRNA-9的真核表达载体，用于基因治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及miRNA-9在制备抑制肝癌转移药物中的应用，属于生物化学与分子生物学
技术介绍
根据世界卫生组织2014年发布的癌症白皮书，肝癌在我国无论男性或者女性的发病率和致死率都极高，严重地影响了人类的生存和健康。恶性肿瘤细胞与普通肿瘤细胞的区别是前者具有转移能力，其转移能力越高，恶性程度也就越高，越难以治愈。肿瘤的转移机制是一个复杂的网络通路，近年来，随着人们对miRNAs的研究发现，有些miRNAs参与调控肿瘤的发生和发展过程，可以将其作为早期诊断或者早期治疗的分子靶标。随着糖科学的迅速发展，有关肿瘤与糖基化修饰之间的关系已经越来越多的被科学家证实。唾液酸转移酶属于脊椎动物唾液酸转移酶家族，该家族包括α-2,3，α-2,6，α-2,8唾液酸转移酶3个亚型。其中α-2,6唾液酸转移酶表达在机体许多种细胞的表面，可催化活化的唾液酸以α-2,6糖苷键的形式连接到细胞膜表面的N-乙酰乳糖胺上。唾液酸作为复合糖的组成部分镶嵌于所有细胞表面以及大多数脊椎动物糖蛋白和糖脂分子的末端最外侧。唾液酸介导或调制了炎症、病原感染、肿瘤发生发展等诸多病理过程，与人类疾病密切关联[1-3]。与正常组织相比较发现，恶性肿瘤组织和恶性肿瘤细胞表面糖链结构发生明显变化。其中，特征连接唾液酸表达的显著上调或下调变化与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和预后不良等相关，有的作为肿瘤标记物或预后标记物，也可能成为肿瘤免疫治疗的靶点[4]。miRNAs是真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。自从1993年，Lee等科学家利用遗传分析的方法在秀丽隐杆线虫中发现了miRNA后，科学家开展了大量关于miRNA相关功能的研究。目前已有很多miRNA被鉴定参与细胞癌变、转移等病理过程。如：miR21、miR122、miR182、miR34a、miR138、Let-7c等分别参与乳腺癌、膀胱癌、肺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的发生和转移过程[5]-[6]。其中，有关miRNA参与调控糖基化修饰的研究也有相关报道。例如，let-7c通过调控甘露糖乙酰基转移酶4的合成(该酶参与了细胞表面糖基化的修饰过程)抑制了小鼠肝癌细胞的转移[7]来自秀丽线虫中的miR-79与其在哺乳动物中同源的miRNA-9通过调控细胞糖基化修饰过程，影响参与哺乳动物神经元转移的两个靶基因SQV-5和SQV-7的合成[8]。然而，关于miRNA-9在小鼠肝癌转移中的作用机制还未有报道，包括其靶基因的研究也仅限于少数基因。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达芯片之上，根据芯片结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞(Hepa1-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-P)和高转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，利用RT-qPCR验证芯片结果，找到在三种细胞中存在显著差异的miRNA-9作为研究的基础。接下来，利用westernblotting实验方法发现St6gal1在三种细胞中的表达量同样存在显著差异，并与miNRA-9在三种细胞中的表达差异吻合。为了验证St6gal1是miRNA-9的靶基因之一，设计实验构建了双荧光素酶报告基因，并将miRNA-9的模拟物:miRNA-9mimic与报告基因共转染至Hepa1-6中，通过检测，证实了St6gal1为miRNA-9的靶基因。最后，将miRNA-9的模拟物和抑制物：miRNA-9mimic、miRNA-9inhibitor分别转染到上述三种细胞中，发现miRNA-9的mimic可以抑制St6gal1在三种细胞中的表达量。同时，miRNA-9在细胞中的过表达可以抑制其增殖、迁移、侵袭和黏附能力。因此,miRNA-9具有抑制小鼠肿瘤细胞的转移能力，可以应用于抑制肿瘤转移药物的开发领域。具体地，本专利技术提供一种miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9的序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9模拟物的的正义链序列如SEQIDNO.2所示，反义链序列如SEQIDNO.3所示。在优选的技术方案中，所述miRNA-9或miRNA-9模拟物用于制备抑制肝癌转移药物。本专利技术还提供miRNA-9的靶基因，该靶基因为St6gal1。在本专利技术所述miRNA-9可以用于制备抑制肝癌等转移性肿瘤转移的药物。具体应用时，可以将miRNA-9的模拟物用于药物设计，也可以构建miRNA-9的真核表达载体，用于基因治疗。附图说明图1表示miRNA-9在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞中的相对表达量的real-timePCR结果；图2表示St6gal1蛋白在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞中的表达量的WesternBlotting实验结果；图3表示St6gal13’UTR区域中与miNRA-9结合位点；图4表示双荧光素酶报告基因检测系统分析miR-9的mimic对St6gal-3’UTR/pGL-3荧光强度的影响；图5表示转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后St6gal1蛋白在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞中的表达量；图6表示miRNA-9的模拟物mimic和抑制物inhibitor在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞的转染效率；图7表示三种细胞分别转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后细胞增殖能力的变化；图8表示Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后细胞迁移能力的变化；图9表示Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后细胞侵袭能力的变化；图10表示不同包被浓度下Hca-F和本文档来自技高网...
【技术保护点】
miRNA‑9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA‑9的序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQIDNO.1所
示。
2.miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9模拟物的的正义
链序列如SEQIDNO.2所示，反义链序列如SEQIDNO.3所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：张嘉宁，韩逸，李文利，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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