一种携带GFAP基因的肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种携带GFAP基因的肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法，其中，该肿瘤细胞株为携带GFAP基因的大鼠神经胶质瘤细胞C6，瘤苗含有前述的携带GFAP基因的大鼠神经胶质瘤细胞C6。本发明专利技术的有益之处在于：通过基因转染获得转基因肿瘤细胞，使用共培养法获得DC疫苗，该DC疫苗具有诱导作用强、安全性高等优点，适于临床应用，具有很大的潜在价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法，具体涉及一种携带GFAP基因的肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法，属于基因工程

技术介绍
近年来，随着对肿瘤免疫逃逸机理的认识以及对肿瘤相关抗原的发现及鉴定，以树突状细胞(DC)抗肿瘤疫苗为代表的主动免疫治疗成为肿瘤防治研究的热点。DC是人体内抗原递呈能力最强、唯一能在体内活化静息T淋巴细胞的抗原递呈细胞，是机体免疫应答的始动者。DC是以主要组织相容性复合物MHCI、II类肽复合物的形式递呈抗原，具有促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中发挥着极其重要的作用。因此被广泛应用于肿瘤疾病疫苗研究。研究表明，肿瘤的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，特别是晚期肿瘤患者，其体内往往存在体液免疫和细胞免疫功能的普遍低下，导致免疫功能低下的原因之一是人体内DC功能的下降。实验证实，从外周血分离出的淋巴细胞仍对多种抗原刺激保持很好的反应能力。因此，通过体外制备DC瘤苗有望成为治疗肿瘤的理想疗法。胶质纤维酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)是星形胶质细胞浆8-10nm的中间丝，是构成胶质细胞的骨架成分。Lawrence等人肯定了GFAP在胶质瘤诊断中的重要价值，尤其认为当对于颅内肿瘤的来源诊断具有困难时，GFAP阳性对于判断肿瘤的胶质细胞来源具有重要的参考意义。可以认为GFAP是胶质瘤区别于其他恶性肿瘤的重要特异性标志物。GFAP也作为鉴定神经胶质瘤的特异性抗原，因而选择GFAP作为神经胶质瘤治疗DC疫苗的抗原具有重要价值。近来，肿瘤疫苗已发展成为一种重要的肿瘤生物治疗手段。与手术治疗、放射治疗相比，生物治疗毒副作用小，特异性高，作用范围更广泛，在肿瘤治疗研究中越来越引起重视。目前，针对各种肿瘤设计了多种转基因瘤苗，如将各种细胞因子转染相关的肿瘤细胞以改善肿瘤细胞的遗传背景，提高免疫原性，诱导更强的免疫应答。将DC和肿瘤细胞融合，可以获得既有DC特殊功能又表达肿瘤抗原的杂合子，使DC摄取肿瘤抗原诱导免疫激活，从而增强对肿瘤的杀伤力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种携带GFAP基因的肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种肿瘤细胞株，其特征在于，该肿瘤细胞株为携带GFAP基因的大鼠神经胶质瘤细胞C6。制备前述的肿瘤细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：构建负载过表达GFAP质粒；Step2：将过表达GFAP质粒共转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6；Step3：筛选稳转细胞株。前述的方法，其特征在于，在Step1中，构建负载过表达GFAP质粒的方法为：(1)通过RT-PCR技术获取一段鼠源性的GFAP基因；(2)将GFAP基因克隆与pGEM-T载体连接；(3)取适量pGEM-GFAP基因和pcDNA3.1(+)质粒，分别用EcoRⅠ和XHoⅠ双酶切，再进行连接反应，连接反应体系为：(4)用连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选，小量扩增后抽提重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GFAP。前述的方法，其特征在于，在Step2中，将过表达GFAP质粒共转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6的方法为：大鼠神经胶质瘤细胞C6常规培养传代，当细胞生长至60％-70％融合时，采用脂质体转染法将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GFAP转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6。一种瘤苗，其特征在于，含有前述的携带GFAP基因的大鼠神经胶质瘤细胞C6。制备前述的瘤苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：取健康的6-8周龄SD大鼠，断颈法处死，浸入75％的乙醇中消毒3-5min，无菌手术取出股骨和胫骨，剔去肌肉组织之后用70％酒精消毒5min，再用PBS洗涤3次，剪去股骨和胫骨两端，用PBS洗涤2次，用灭菌注射器抽取无血清RPMI-1640培养基，自股骨和胫骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓，直至股骨和胫骨变白，过200目的钢网，收集骨髓细胞，1000g离心5min之后弃上清，加入3-10mlTris-NH4Cl处理2-3min后去除红细胞，用PBS洗涤2次，获得DC细胞；Step2：将DC细胞浓度调整至106个/ml，重悬于含10ng/mlGM-CSF、10ng/mlIL-4和10％FBS的完全培养液中培养，每2天半量换液一次；Step3：培养至第5d时，向完全培养液中加入经GFAP基因修饰的大鼠神经胶质瘤细胞C6共培养，经GFAP基因修饰的大鼠神经胶质瘤细胞C6的浓度为100μg/ml；Step4：培养至第6d时，向完全培养液中加入LPS刺激DC细胞成熟，培养48h，收集悬浮和轻微贴壁的细胞，此细胞即为培养成熟的DC细胞。本专利技术的有益之处在于：通过基因转染获得转基因肿瘤细胞，使用共培养法获得DC疫苗，该DC疫苗具有诱导作用强、安全性高等优点，适于临床应用，具有很大的潜在价值。附图说明图1是PCR产物的电泳EB染色图；图2是凝胶电泳图；图3是凝胶摄像图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。一、制备携带GFAP基因的大鼠神经胶质瘤细胞C61、构建负载过表达GFAP质粒(1)通过RT-PCR技术获取一段鼠源性的GFAP基因。(2)将GFAP基因克隆与pGEM-T载体连接。鉴定获取的基因：GFAP基因克隆与pGEM-T载体连接后，先转化感受态细胞DH5α，然后筛选白色菌落过夜培养，再进行质粒抽提，酶切鉴定。参见图1，鉴定结果为：PCR产物经电泳EB染色显示在1300bp左右有一条特异性条带，其与预期的GFAP基因大小一致。(3)取适量pGEM-GFAP基因和pcDNA3.1(+)质粒，分别用EcoRⅠ和XHoⅠ双酶切，再进行连接反应，连接反应体系为：以水代替目的基因片段作为对照。(4)用连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选，小量扩增后抽提重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GFAP。鉴定是否成功克隆GFAP基因：用EcoRⅠ和XHoⅠ双酶切重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GFAP，进行琼脂糖凝胶电泳初步鉴定并测序。结果：(1)参见图2，凝胶电泳结果可见有两条特异性条带，分子量大于2000bp左右的片段为pcD-NA3.1(+)载体片段，分子量1300bp左右的片段为目的条带GFAP基因片段；(2)测序结果与GenBank的GFAP序列一致。表明：pcDNA3.1(+)质粒已成功克隆GFAP基因。2、培养大鼠神经胶质瘤细胞C6将大鼠神经胶质瘤细胞C6培养于含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2孵箱中培养，每3天换液一次，当细胞生长至80-90％融合时，用含EDTA的胰酶消化后经行传代。3、将过表达GFAP质粒共转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6大鼠神经胶质瘤细胞C6常规培养传代，当细胞生长至60％-70％融合时，采用脂质体转染法将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GFAP转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6。将pcDNA3.1(+)空质粒转染到C6做对照。鉴定是否转染成功：参照Trizol试剂盒说明书进行操作，常规抽提转染pcDNA3.1(+)-GFAP质粒和pcDNA3.1(+)空质粒的大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤细胞株，其特征在于，该肿瘤细胞株为携带GFAP基因的大鼠神经胶质瘤细胞C6。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤细胞株，其特征在于，该肿瘤细胞株为携带GFAP基因的大鼠神经胶质瘤细胞C6。2.制备权利要求1所述的肿瘤细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：构建负载过表达GFAP质粒；Step2：将过表达GFAP质粒共转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6；Step3：筛选稳转细胞株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在Step1中，构建负载过表达GFAP质粒的方法为：(1)通过RT-PCR技术获取一段鼠源性的GFAP基因；(2)将GFAP基因克隆与pGEM-T载体连接；(3)取适量pGEM-GFAP基因和pcDNA3.1(+)质粒，分别用EcoRⅠ和XHoⅠ双酶切，再进行连接反应，连接反应体系为：(4)用连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选，小量扩增后抽提重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GFAP。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在Step2中，将过表达GFAP质粒共转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6的方法为：大鼠神经胶质瘤细胞C6常规培养传代，当细胞生长至60％-70％融合时，采用脂质体转染法将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GFAP转染到大鼠神经胶质瘤细胞C6。5.一种瘤苗，其特征在于，含有权利要求1所述的携带G...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅松涛，索金荣，解军，刘记瑛，
申请(专利权)人：北京爱富迪医药科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11