【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及一种。
技术介绍
血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)是一种以二硫键连接成同源二聚体的、分泌性的、糖基化的多肽因子，早期亦称作血管通透因子(vascular permeability factor, VPF),是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor),可在体内诱导血管新生。人的VEGF蛋白(humanvascular endothelial growth factor, hVEGF)是于1989年由美国的两间生物科技公司的科学家分别成功纯化与鉴定，并克隆与测定了其基因序列，证明VPF与VEGF是同一基因编码的同一蛋白。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，以二硫键组成二聚体。VEGF分解的单体无活性，去除N2糖基对生物效应无影响，但可能在细胞分泌中起作用。由于mRNA不同的剪切方式，产生出分别 VEGF121、VEGF145, VEGF165, VEGF185, VEGF1...
【技术保护点】
一种可溶性Trx?hVEGF165融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）克隆hVEGF165基因：用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165特异引物中引入BamH?I酶切位点和Hind?III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20?T载体，得质粒hVEGF165/pMD20?T，经过测序确定为正确表达序列；（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32和步骤（1）所得的质粒hVEGF165/pMD20?T经过Hind?III及BamH?I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hVEGF165；（3...
【技术特征摘要】
1.一种可溶性Trx-hVEGF165融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤 (1)克隆hVEGF165基因用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20_T载体，得质粒hVEGF165/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列； (2)构建原核表达载体将表达载体pET32和步骤(I)所得的质粒hVEGF165/pMD20-T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hVEGF165 ； (3)大肠杆菌表达菌株转化子的筛选将步骤(2)所得的重组载体pET32/hVEGF165转化到大肠杆菌TOPlO菌株中，再从大肠杆菌T0P10菌株中提取重组载体pET32/hVEGF165 ;用热激法将重组载体pET32/hVEGF165转到大肠杆菌表达菌株BL21中，利用LB氨苄青霉素Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32/hVEGF165的大肠杆菌表达菌株转化子； (4)Trx-hVEGF165融合蛋白的表达将步骤(3)所得的pET32/hVEGF165大肠杆菌表达菌株转化子在35 °C _37°C培养至OD6tltl为O. 4-0. 8时，加入浓度为O. 05-1. OmM的IPTG，于16-20°C诱导8-12小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量可溶性的重组融合蛋白Trx-hVEGF165 ； (5)Trx-hVEGF165融合蛋白的纯化利用镍亲合层析法对Trx_hVEGF165融合蛋白进行纯化，后再米用PBS透析和超滤浓缩。2.一种可溶性hVEGF165重组蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤 (1)克隆hVEGF165基因用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴东海，李洪波，徐爱民，金守光，李娜，李侍武，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：
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