一种模拟重组无痕克隆方法技术

本发明专利技术涉及一种模拟重组无痕克隆方法，所述方法是设计载体引物时，在引物的5’末端要分别增加与目的基因序列相同的一段DNA碱基，所得载体DNA末端和目的基因内部具有匹配区域，再将载体DNA和目的基因混合，先后用λ?Exonuclease和T4?DNA聚合酶处理，获得重组DNA。本发明专利技术的有益效果主要体现在：（1）不需要经PCR扩增目的基因，减少了PCR引起的突变；（2）可以从DNA混合物中特异性地克隆目的片段；（3）不留酶切位点的痕迹。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
利用引物5’末端加酶切位点及其保护碱基，PCR扩增目的基因片段，酶切后再连接入特定载体中，已成为经典的克隆方法。这种方法也存在着一些问题:当载体上的酶切位点与目的基因片段有冲突时，往往要改造载体；当目的基因GC含量高或具有稳定的二级结构时，我们常常难以获得足量的PCR扩增产物；此外，当目的基因片段很长时，容易导致扩增效率低、突变率高的问题。Fu J.等人(2012)专利技术了一种利用全长RecE、RecT、Redy及RecA等重组酶在大肠杆菌体内实现了对大片段DNA间进行重组的方法(Fu J,Bian X, Hu S，Wang H, Huang F，Seibert PM, Plaza A, Xia L, Miiller R, StewartAF, Zhang Y.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombinationand facilitates direct cloning for bioprospecting.Nat Biotechnol.2012May ;30(5):440-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种模拟重组无痕克隆方法，所述方法包括：（1）载体DNA制备：以克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，并在引物5’端分别加上与目的基因匹配的长度为20~30bp的序列，所得上游引物记为primer1，下游引物记为primer2，以primer1和primer2为引物进行PCR扩增获得载体DNA；?（2）目的基因制备：经酶切或扩增获得包含目的基因的片段；（3）基因重组：将步骤（1）载体DNA和步骤（2）所得片段混合，先加入λ?Exonuclease，37℃反应30?min?，72℃温浴5min?，50℃温浴30min，然后温度降至37℃，加入?T4?DNA聚合酶和d...

【技术特征摘要】
1.一种模拟重组无痕克隆方法，所述方法包括:(1)载体DNA制备:以克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，并在引物5’端分别加上与目的基因匹配的长度为2(T30bp的序列，所得上游引物记为primerl,下游引物记为primer2,以primerl和primer2为引物进行PCR扩增获得载体DNA ；(2)目的基因制备:经酶切或扩增获得包含目的基因的片段；(3)基因重组:将步骤(I)载体DNA和步骤(2)所得片段混合,先加入λExonuclease,37°C反应30 min，72°C温浴5min，50°C温浴30min，然后温度降至37°C，加入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反应15 min，获得重组DNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因为SoxlO基因的编码区，所述方法如下:(1)载体DNA制备:以pGEX-4T-l载体质粒为模板，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴忠敏，齐瀛川，孙淑慧，邱猛生，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：