用于表征重组多克隆蛋白质的方法技术

本发明专利技术系提供表征平台，其可用来评估在生产期间，由多克隆细胞系产生之不同抗体的量，以及存在于多克隆产物中之抗体的批次间一致性。结构的表征平台是基于移除重链并经由层析分离技术分离剩下的轻链，接着对完整的轻链种类进行质谱分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术系关于用于结构表征在重组多克隆抗体组合物中之不同轻链种类族群的方法。该方法可用于定量和定性分析，并可用于，例如分析批次间一致性，以及评估在制造 行程期间的组合物稳定性，并判定给定一批是否满足某些预先定义的释放规格。专利技术背景WO 2006/007853揭示了表征包含重组多克隆抗体之样品的程序。该方法涉及消化 抗体链，以释放出标志肽，其为每个特定蛋白质种类所特有的(所谓的’标志肽’法)。预防或治疗用途之重组多克隆蛋白质的工业生产之先决条件为在培养和下游加 工的期间内维持蛋白质多样性。因此，能够在任何想要的时间点，并在任何相关样品中，监 视和测量产生多克隆蛋白质之多克隆细胞系的克隆多样性，以及在多克隆蛋白质中之个别 蛋白质的相对呈现是重要的，因此允许分析表达系统在单一行程中的稳定性，以及终产物 的批次间变异。必须分析在由个别多克隆工作细胞库产生的不同批药物物质中的批次间一致性， 以确保特定一批是在预先定义的释放规格中。这类分析会获益于能够判定个别蛋白质在蛋 白质之多克隆混合物中之相对比例的方法。在WO 2006/007853中描述的标志肽法，提供了鉴定和表征借着酶促消化来产制 的独特之疏水性可变区衍生肽的LC-MS (液相层析-质谱)法，其允许鉴定在重组多克隆抗 体中的特定抗体种类。Adamczyk 等 人(Rapid Communications in Mass Spectrometry 14， 49-51(2000))描述了借着纯化动物-衍生之(即非-重组的)多克隆抗体，还原在轻和重 链之间的二硫键，并对重和轻链两者进行LC-MS，分析多克隆抗体，以提供血清_衍生之多 克隆抗体的轮廓。Wan 等人(J. of Chromatography A 913，437-446 (2001))描述对在 CHO 细胞中产 生之重组单克隆抗体使用LC-MS，以定量直接来自细胞培养物的抗体糖型(glycoform)。将 来自细胞培养物的重组抗体样品还原，并直接注射到HPLC系统内，其与质谱仪连接。在WO 2006/007853中提供更多的专利技术背景。专利技术概述本专利技术提供在重组多克隆抗体组合物中之轻链种类的表征方法，该方法包括下列 步骤a)制造并纯化重组多克隆抗体组合物；b)还原连接重和完整轻链的半胱氨酸_桥；c)分离重链和完整轻链；d)使该完整轻链接受至少一个层析分析，其系根据物_化特性分离蛋白质；e)使来自步骤(d)之经分离完整轻链接受质谱；及f)分析在步骤(e)中获得的数据，以表征在该重组多克隆抗体组合物中之完整轻 链种类。为了降低该方法之复杂性，并改良从经分离之完整轻链中获得的数据组，我们已 经发现必需分离重链与轻链。我们认为这可能是因为在重链之物_化特性中的高度异质 性，其干扰轻链的表征。而且，我们意外地发现当使用完整轻链时，我们获得对在重组多克 隆抗体中轻链抗体之组成更精确的定量。与标志肽法相比较，更进一步的优点为将程序简 化成较少的步骤，使其更稳健且更方便使用。欲表征之完整轻链蛋白质，典型地衍生自已知的遗传序列，即用来创造多克隆抗 体之序列为已知的。因此，步骤(f)典型地涉及比较在步骤(e)中获得之数据与遗传数据， 如可从遗传序列(或在本文中描述之其它遗传分析)来判定每个完整轻链的推论分子量， 或步骤(f)涉及比较在步骤(e)中获得之数据与自经分离轻链种类之分子量判定获得的数 据。可借着以单克隆抗体之方式表达该抗体，分离轻和重链，并使用质谱判定该轻链之分子 量，获得经分离之轻链种类的分子量。比较在步骤(e)中获得之数据与来自分子量判定之 数据，会考虑影响分子量的翻译后修饰。虽然本专利技术仅关于轻链的分析，最后的结果可能涉及测定完整抗体在组合物中的 量及/或相对比例，因为在轻链和重链之间总是存在1 1之比例。有可能估计每个抗体 种类的实际量(按重量计)，因为事先已从其编码序列中得知与任何给定轻链关联之重链 的结构。这亦可借着使用，例如质谱，测量每个经分离重链的分子量来进行，以便考虑翻译 后修饰(特别是糖基化)。 本专利技术亦提供检测在二或更多个重组多克隆抗体组合物中，在完整轻链族群之间 变异的方法，包括对二或更多个重组多克隆抗体组合物的每一个进行上文用于表征在重组 多克隆抗体组合物中之轻链种类的方法，并判定在该二或更多个重组多克隆抗体组合物 中，在完整轻链族群之间的任何变异。附图简述附图说明图1.经还原和经烷基化SymOOl之SEC(尺寸排阻层析)的典型层析谱。HC =重 链，LC=轻链。图2. SymOOl轻链的典型LC-MS层析谱。在上方显示总离子计数(TIC)迹，并在下 方显示在214nm处记录的UV迹。图3. SymOOl轻链的典型UV层析谱，连同个别抗体的停留时间。图4. SymOOl轻链的TIC (上方)，连同RhD159之经萃取离子层析谱(XIC)(下方)。图5. RhD 159的XIC (上方)，连同相对应之m/z光谱。图6.在图5中出示之m/z光谱的放大(上方)，连同相对应之XIC(下方)。图7.注射不同量的SymOOl WS-ILC,克隆的线性(η = 3)。图8.两批不同SymOOl的分析(η = 3)。专利技术详述定义术语“抗-独特型抗体”意指全长抗体或其片段(例如Fv、scFv, Fab, Fab'或 F (ab) 2)，其特异性地与多克隆蛋白质之个别成员的变异部分结合。优选地，本专利技术之抗-独 特型抗体特异性地与多克隆抗体或多克隆TcR之个别成员的变异部分结合。该抗-独特型 抗体特异性优选地针对多克隆抗体或多克隆T细胞受体之个别成员的抗原特异性_部分， 所谓的V-区。然而，亦可显示对个别成员之限定亚_族群，例如在混合物中呈现之特定VH基因家族的特异性。术语“抗_独特型肽”意指特异性的肽_配体，其能够特异性地结合并因此鉴定在 同源蛋白质之混合物内的个别蛋白质成员。优选地，本专利技术之抗-独特型肽特异性地与多 克隆抗体或多克隆TcR的个别成员结合。本专利技术之抗_独特型肽优选地针对个别抗体或个 别T细胞受体之序列的抗原_特异性部分。然而，抗_独特型肽亦可显示对个别成员之限 定亚-族群的特异性。术语“克隆多样性”或“多克隆”意指多克隆蛋白质、编码其之核酸序列，或生产其 之多克隆细胞系的变异性或多样性。变异性之特征在于在多克隆蛋白质之个别成员之氨基 酸序列上的差异，或在编码序列文库之核酸序列上的差异。关于多克隆细胞系，可借着在该 细胞系内呈现之核酸序列的变异性来评估克隆多样性，例如像是以单一位点整合到个别细 胞之基因组内。然而，亦可根据在细胞系内， 在细胞表面上呈现之氨基酸序列的变异性来评 估。术语“表位”意指在抗原性分子中，T-细胞受体或抗体会与之结合的部分。抗原或 抗原性分子通常会同时存在数个或甚至许多表位。术语“抗体”描述血清的功能性组份，且经常以分子之集合(抗体或免疫球蛋白、 片段等等)或以单一分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)提及。抗体分子能够与特定的表 位(抗原或抗原性表位)结合或反应，其可转而导致诱导免疫学效应物机制。通常将个别 抗体分子视为单特异性的，而抗体分子之组合物可能是单克隆的(即由相同的抗体分子组 成)或多克隆的(即由与在相同抗原上或在可区别之不同抗原上相同或不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表征在重组多克隆抗体组合物中之轻链种类的方法，该方法包括下列步骤：ａ）制造并纯化重组多克隆抗体组合物；ｂ）还原连接重和完整轻链的半胱氨酸－桥；ｃ）分离重链与完整轻链；ｄ）使该完整轻链接受至少一个层析分析，其系根据物－化特性分离蛋白质；ｅ）使来自步骤（ｄ）的该经分离之完整轻链接受质谱；及ｆ）分析在步骤（ｅ）中获得的数据，以表征在该重组多克隆抗体组合物中之完整轻链种类。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】DK 2007-11-22 PA200701664;DK 2007-11-28 PA20070168一种用于表征在重组多克隆抗体组合物中之轻链种类的方法，该方法包括下列步骤a)制造并纯化重组多克隆抗体组合物；b)还原连接重和完整轻链的半胱氨酸-桥；c)分离重链与完整轻链；d)使该完整轻链接受至少一个层析分析，其系根据物-化特性分离蛋白质；e)使来自步骤(d)的该经分离之完整轻链接受质谱；及f)分析在步骤(e)中获得的数据，以表征在该重组多克隆抗体组合物中之完整轻链种类。2.如权利要求第1项之方法，其中该完整轻链包含整个轻链氨基酸序列。3.如权利要求第1或2项之方法，其中该完整轻链具有谷氨酰胺以外的N-端氨基酸残基。4.如权利要求第1至3项中任一项之方法，其中该层析分析是基于尺寸以外的至少一 个物-化特性。5.如权利要求第4项之方法，其包括基于至少一个物_化特性的个别层析分析，该 物_化特性系选自由净电荷、疏水性、等电点、和亲和力所组成之群组。6.如权利要求第5项之方法，其中该个别层析分析是基于净电荷。7.如权利要求第1至6项中任一项之方法，其中以多维层析进行该层析分析。8.如权利要求第1至7项中任一项之方法，其中该层析分析是或包括高分辨率液相层析。9.如权利要求第1至8项中任一项之方法，其中该多克隆抗体组合物是细胞培养物级 分，该细胞培养物级分包含该培养物之细胞。10.如权利要求第1至9项中任一项之方法，其中步骤(a)涉及从一或多个细胞培养物 上清液来制备多克隆抗体组合物。11...

【专利技术属性】
技术研发人员：朗K拉斯马森，托本P弗兰森，安德斯恩斯特龙，厄兰霍姆伯格，皮亚珀森，
申请(专利权)人：西福根有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]