发明专利技术涉及protocadherin1(pcdh1)基因的部分序列在制备多克隆抗体和表达检测中的应用，具体而言，是对鸡pcdh1基因的部分序列进行了PCR扩增，插入到表达载体，并通过在大肠杆菌E.coliBL21中原核表达和融合蛋白亲和纯化，把纯化的蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化后通过足垫等部位多点注射免疫SD大鼠,快速地产生针对目的抗原的特异性抗体。利用该方法快速制作的免疫血清，对不同发育阶段鸡胚中的pcdh1基因的表达情况进行检测，说明利用本方法制作的针对pcdh1蛋白部分肽段的多抗有望成为pcdh1基因蛋白表达检测的有效工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多克隆抗体制作技术，具体而言，就是利用设计的特定引物，通过相应手段原核表达和纯化目的蛋白，免疫动物制作免疫血清，进而通过实验阐明本抗血清用作基因蛋白表达检测的可行性。
技术介绍
原I丐粘蛋白(Protocadherins, pcdh)是一种带有亲同种抗原粘附活性的跨膜蛋白，是钙粘蛋白超家族中最大的亚群。/7 *主要在中枢神经系统中表达，迄今为止已经发现大约有60多种在大脑中表达。现有的研究表明对神经元突触的发育有直接的影响。pcdh分子不仅可以作为粘附分子加强神经突触的连接，而且还可以作为受体在信号转导过程中起到一定作用。此外，/7 *参与细胞迁移和细胞分选，神经元回路和神经突触的建立以及细胞存活和细胞生长抑制。一箜PCdh基因的突变已经与一些人类疾病联系在了一起。比如，功能的缺失会导致动脉管壁的结构和功能发生改变，通过启动子的高度甲基化使沉默表达会导致17肿瘤抑制活性的消失，说明PCdhM的表达可以抑制食管癌的发生；临床研究表明等位突变可导致隐形视网膜色素变性'pcdtm的突变或者缺失会造成女性患家族性的癫痫；Koppelman等发现是气道高反应的易感基因，又有研究表明I是引发哮喘的并且在呼吸道上皮组织表达的一个新的易感基因。虽然目前我们对Pci*的功能有了一定的了解，但是有些Pci*在胚胎发育及病理过程中的时空表达及作用机制仍然不清楚。本专利技术所述以鸡源I (GeneBank收录号NM_001045827)为研究对象，建立制备其多克隆抗体的方法以及制备鸡源的多克隆抗体和用于其表达检测，迄今未见相关报道。本专利技术目的在于，通 过克隆、异源表达和纯化特定肽段的融合蛋白，作为抗原免疫动物，制作多克隆抗体，利用此抗体检测鸡I基因在各种生理病理条件下的表达，进而提供一种的表达检测试剂用于基础及医疗实践。
技术实现思路
本专利技术首先根据鸡基因(GeneBank收录号NM_001045827)的序列，先用Globplot2.3软件分析的跨膜区,然后再用DNAStar引物设计软件设计I膜内区段引物: 上游引物 5’ -GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3, 下游引物 5’ -GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3> ； 上游引物和下游引物分别添加和及^RI酶切位点(下划线所示)。从一周左右的鸡胚脑组织中提取总RNA，RT-PCR反转录合成cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增膜外目的片段。将目的片段连入表达载体，筛选阳性重组质粒。本专利技术目的之一在于提供一种鸡源I特异性多克隆抗体。本专利技术的目的之二在于提供制备该克隆抗体的方法。本专利技术的目的之三在于提供克隆表达该肽段的序列引物，该引物还可以用于RT-PCR来检测该基因的mRNA表达水平。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种鸡源特异性多克隆抗体，其特征在于所述的特异性多克隆抗体是将氨基酸序列的第33位到204位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。上述的特异性多克隆抗体是将第33位到204位氨基酸残基对应的cDNA序列构建到原核表达质粒PGEX-2TK中，得到重组质粒pGEX-2TK-pcdhl01，再将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到可溶表达带有鸡源I第33位到204位氨基酸残基的多妝融和蛋白。上述的特异性多克隆抗体是将多肽融和蛋白作为抗原免疫动物而获得。一种制备上述的鸡源I特异性多克隆抗体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.Mpcdhl氨基酸序列进行了蛋白跨膜结构预测，其中第I到239位氨基酸为胞外段结构； b.用PCR扩增处于胞外段第33到204位氨基酸残基对应的cDNA，重组入pGEX_2TK中，构建成 pGEX-2TK-pcdhl01 载体； c.将载体转化到疋BL21(DE3)中，原核可溶表达表达得到包含目的DCFI多肽的可溶性融合蛋白； d.将融合蛋白为抗原免疫动物燥，得到以上述制备的蛋白，按照多抗免疫方案进行动物免疫，得到特异性多克隆抗体。利用Western Blot技术对制备得到的多克隆抗体进行特异性评测。同时利用制备的上述多克隆抗体能够检测到鸡胚组织pcdhI蛋白的表达。制备的多克隆抗体也检测到了的蛋白表达变化，说明制备的多克隆抗体可以用来检测鸡胚不同时期的表达水平。本专利技术为此提供了以下的生物学实验: 1)pcdhI基因的RT-PCR检测实验； 2)Western blotting方法检测鸡胚组织中I的表达水平。本专利技术的优点与积极效果在于，设计合成了克隆鸡第33位到204位氨基酸残基的引物，并且此引物可以用于RT-PCR检测pcdh I基因的mRNA表达水平；制作了针对鸡pcdhl蛋白的鼠源多克隆抗体,实验证明此抗体可用于Western blot检测的蛋白表达水平。附图说明 图1 pcdhl基因pcdh胤片段PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。其中: 泳道 M.DNA marker ； 泳道1.PcdhlQl PCR扩增片断；缩写:bp, base pair。图2重组表达载体的PCR及酶切检测。其中: 泳道1.PCR扩增pET32a-pcdhl01产生的目的片断；泳道 2.Βαω I 和 &oR I 双酶切 pET32a_pcdhl01 ；泳道 3.pET32a-pcdhl01 ； 泳道4.PCR扩增pGEX-2TK-pcdhl01产生的目的片断；泳道 5.Bam^ I 和 &oR I 双酶切 pGEX_2TK-pcdhl01 ；泳道 6.pGEX-2TK-101 ；缩写:bp, base pair ；M, DNA marker。图3 GST-PCDH101融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测。其中: 泳道1.未诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 泳道2.诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 泳道3.未诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21裂解沉淀； 泳道4.诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21裂解沉淀； 泳道5.未诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21裂解上清； 泳道6.诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21裂解上清。图4 SDS-PAGE分析(His)6-1Ol融合蛋白和纯化蛋白。其中: 泳道1.未诱导的含pET32a-pcdhl01质粒的BL21总蛋白； 泳道2.1PTG诱导的含pET32a-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 泳道3.1PTG诱导的含pET32a-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21沉淀； 泳道4、5.1PTG诱导的含pET32a-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21上清； 泳道6.纯化的(His)6-PCDHlOl融合蛋白。图5 SDS-PAGE分析重组GST-PCDH101融合蛋白。其中: 泳道1.未诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 泳道2.1PTG未诱导的含pGEX-2TK-pcdhl01质粒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡pcdh1特异性多克隆抗体的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)?根据鸡pcdh1基因，设计并合成引物：?上游引物5’?GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT?3’，下游引物5’?GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA?3’；?通过RT?PCR扩增鸡pcdh1基因片段，其全长为516?bp；(2)?将步骤(1)获得的pcdh1基因片段连入表达载体pGEX?2TK中，将连接产物转化大肠杆菌E.coli?DH5α感受态细胞，筛选得到重组表达质粒pGEX?2TK?pcdh101；(3)?将步骤(2)获得的表达鸡pcdh1基因片段的重组表达质粒转化到大肠杆菌E.coli?BL21中，用LB液体培养基，21℃培养至对数生长期后，诱导；(4)?将诱导后的菌体在4℃下离心收集，用去离子水和PBS分别清洗，加入溶菌酶并超声裂解破碎，离心破碎后的菌液，收集上清；(5)?使用Glutathione?Sepharose?4B亲和层析柱纯化融合蛋白；(6)?把纯化后的融合蛋白作为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李永海，李萌，陈国荣，王琳，陈红丽，刘涌涛，赵兴华，李超英，丰慧根，林俊堂，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：
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