支链脂肪酸以及其生物性生产制造技术

本发明专利技术提供了生产反异脂肪酸的方法。所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：丙酮酸至柠苹酸的转化；柠苹酸至柠康酸的转化；柠康酸至β-甲基-D-苹果酸的转化；β-甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；或苏氨酸至2-氧代丁酸的转化。任选地，所述细胞还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列：所述多肽催化下列反应：2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化、2-乙酰-2-羟丁酸至2,3-二羟基-3-甲基戊酸的转化、和/或2,3-二羟基-3-甲基戊酸至α-酮基-3-甲基戊酸的转化。本发明专利技术也提供了生产反异脂肪酸的细胞以及使用所述细胞生产反异脂肪酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产脂肪酸的细胞和方法，更具体地讲涉及生产反异和/或异支链脂肪酸的细胞和方法。
技术介绍
反异和异支链脂肪酸是具有分别在n-2和η-l碳上具有甲基支链的羧酸。类似于其他脂肪酸，反异和异支链脂肪酸用于制造例如食品、洗涤剂、杀虫剂和个人护理产品如洗发剂、皂和化妆品。反异和异支链脂肪酸能够通过化学合成或能够从某些动物和细菌中分离。虽然某些细菌例如大肠杆菌非天然生产反异或异支链脂肪酸，但一些细菌如芽孢杆菌属和链霉菌属的成员天然生产反异和异支链脂肪酸。例如，除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都生产具有15个和17个总碳的反异脂肪酸和具有15个、16个和17个总碳的异支链脂肪酸(Cropp等人,Can.J.Microbiology 46:506-14(2000)；De Mendoza等人，Biosynthesis and Function of Membrane Lipids, in Bacillussubtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonenshein 和 Losick 编辑，AmericanSociety for Microbiology, (1993))。然而,这些生物体不生产商业可用量的反异和/或异支链脂肪酸。这些天然生物体的另一限制是它们似乎不生产中链反异和/或异支链脂肪酸如具有11个或13个碳的那些。同样地，需要商业可用的生物合成生产的反异和/或异支链脂肪酸。此外，需要生产此类反异和/或异支链脂肪酸的方法。 专利技术概述提供了生产反异和/或异支链脂肪酸(本文也称为反异和/或异脂肪酸)的细胞和方法。多核苷酸包含编码催化与细胞中支链脂肪酸生产相关联的反应的多肽的核酸序列。在一个方面，本专利技术提供生产反异脂肪酸的方法。所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种:(aa)丙酮酸至柠苹酸的转化；(bb)柠苹酸至柠康酸的转化；(cc)柠康酸至β -甲基-D-苹果酸的转化；(dd) β -甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；或(ee)苏氨酸至2-氧代丁酸的转化。所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。在一些实施方案中，所述细胞还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种:(ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化，(gg) 2-乙酰-2-羟丁酸至2，3- 二羟基-3-甲基戊酸的转化，或(hh) 2，3- 二羟基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的转化。任选地，所述方法还包括从培养物中提取反异脂肪酸或从培养物中提取来源于反异脂肪酸的产物。本专利技术也提供细胞，所述细胞包含下列多核苷酸:包含编码苏氨酸脱氨酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α -酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述细胞中表达。此外，本专利技术提供细胞，所述细胞包含下列多核苷酸:包含编码朽1苹酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链a -酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述细胞中表达。任选地，所述细胞还包含下列多核苷酸:包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和/或包含编码硫酯酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。本专利技术也提供了通过培养细胞生产反异脂肪酸的方法。在某些实施方案中，提供了具有至少一种外来的多核苷酸的细胞。作为另外一种选择或除此之外，所述细胞包含过表达的多核苷酸。所述多核苷酸具有编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的一种:异亮氨酸至2-酮基，3-甲基戊酸的转化；2-酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的转化；2_甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的转化；2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；或酰基-ACP至反异脂肪酸的转化。包含外来的多核苷酸的细胞比不包含所述外来的多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。本专利技术也提供了提高细菌细胞中反异脂肪酸的方法。所述方法包括在细菌细胞中表达编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反应中的一种:2_酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的转化；2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的转化；2_甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；或酰基-ACP至反异脂肪酸的转化，以及在允许细胞生产多肽的条件下培养所述细菌细胞使得反异脂肪酸生产。本专利技术还提供了生产反异脂肪酸的大肠杆菌细胞。 还提供了提高细胞中反异脂肪酸的方法。所述方法包括在细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码外来的支链氨基酸氨基转移酶、外来的支链a -酮酸脱氢酶(BCDH)和外来的3-酮脂酰-ACP合酶；以及在使得反异脂肪酸生产的条件下培养所述细胞。在某些实施方案中，提供了生产反异脂肪酸的方法。所述方法包括培养包含至少一种外来的多核苷酸的至少一种细胞，所述多核苷酸编码至少一种多肽，其能够在使得反异脂肪酸生产的条件下从异亮氨酸中生产反异脂肪酸。此外，在某些实施方案中，还提供了包含至少两种外来的多核苷酸的细胞。所述外来的多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少两种:亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的转化；缬氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的转化；2_酮基，4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的转化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的转化；3_甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2_酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的转化；2-甲基丙酰-Cok至2-甲基丙酰-ACP的转化；2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的转化；3_甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的转化；或酰基-ACP至异脂肪酸的转化，并且其中包含所述外来的多核苷酸的细胞比不包含所述外来的多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的异脂肪酸。还提供了提高细菌细胞中异脂肪酸的方法。所述方法包括在细菌细胞中表达编码至少两种多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反应中的至少两种:亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的转化；缬氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的转化；2_酮基，4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的转化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的转化；3_甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2_酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的转化；2_甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的转化；2_甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的转化；3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.22 US 61/289,039;2010.12.20 US 12/972,8221.一种生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种: (aa)丙酮酸至柠苹酸的转化； (bb)柠苹酸至柠康酸的转化； (Ce)朽1康酸至β -甲基-D-苹果酸的转化； (dd) β -甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；或 (ee)苏氨酸至2-氧代丁酸的转化 其中所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。2.按权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述细胞暴露于硫胺素。3.按权利要求1所述的方法，所述方法还包括从培养物中提取反异脂肪酸。4.按权利要求1所述的方法，所述方法还包括从所述培养物中提取来源于反异脂肪酸的产物。5.按权利要求1所述的方法，其中所述细胞还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种: (ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化， (gg) 2-乙酰-2-羟丁酸至2，3- 二羟基-3-甲基戊酸的转化，或 (hh) 2，3- 二羟基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的转化。6.按权利要求5所述的方法，其中所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码催化3、4、5、6、7或全部反应的多肽。7.按权利要求5所述的方法，其中所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码催化反应(aa)、(bb)、(cc)和(ff)的多肽。8.按权利要求5所述的方法，其中所述细胞包含下列多核苷酸:编码柠苹酸合酶的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、或它们的组合。9.按权利要求8所述的方法，其中所述细胞包含下列多核苷酸:编码柠苹酸合酶的外来的多核苷酸、编码乙酰羟酸合酶的外来的或过表达的多核苷酸、编码异丙基苹果酸异构酶的外来的或过表达的多核苷酸和编码异丙基苹果酸脱氢酶的外来的或过表达的多核苷酸。10.按权利要求8所述的方法，其中所述柠苹酸合酶是来源于詹氏甲烷球菌CimA。11.按权利要求8所述的方法，其中所述异丙基苹果酸异构酶是大肠杆菌LeuCD。12.按权利要求8所述的方法，其中所述异丙基苹果酸脱氢酶是大肠杆菌LeuB。13.按权利要求8所述的方法，其中所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH (G14D)、大肠杆菌IlvGM或枯草芽孢杆菌IlvBH。14.按权利要求5所述的方法，其中所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码催化反应(ee)和(ff)的多肽。15.按权利要求5所述的方法，其中所述细胞包含下列多核苷酸:编码苏氨酸脱氨酶的外来的或过表达的多核苷酸和编码乙酰羟酸合酶的外来的或过表达的多核苷酸。16.按权利要求15所述的方法，其中所述苏氨酸脱氨酶是大肠杆菌TdcB。17.权利要求15所述的方法，其中所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH (G14D)、大肠杆菌IlvGM或枯草芽孢杆菌IlvBH。18.按权利要求5所述的方法,其中所述一种或更多种外来的或过表达的多核苷酸 (i)包含核酸序列，所述核酸序列与如SEQID N0:32、36、42、43、46、51、57、62、68或83所示的核酸序列具有至少约90%的同一性，或 (ii)编码多肽，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与如SEQID N0:33、39、40、41、47、48、52、53、58、65、66、67、84或85所示的氨基酸序列具有至少约90%的同一性。19.按权利要求5所述的方法，其中所述细胞经修饰以降低支链氨基酸氨基转移酶的活性。20.按权利要求5所述的方法，其中所述细胞还包含下列多核苷酸:包含编码支链氨基酸氨基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α -酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码酰基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·W·桑德斯，徐隽，P·R·格林，D·B·库蒂，Z·S·坎巴塔，
申请(专利权)人：宝洁公司，
类型：
国别省市：