自删除质粒制造技术

提供了制备无选择标记基因的质粒的方法，包括在不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组的宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，随后在能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组的另一宿主细胞环境中培养所述质粒，从而去除所述选择标记基因。还提供了通过所述方法制备的质粒在制备用于治疗和疫苗目的的重组蛋白、制备治疗性DNA和DNA疫苗以及使用活细菌载体向患者递送重组蛋白和DNA中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法。具体而言，本专利技术涉及在一定条件下培养含有选择标记基因的质粒的方法，所述条件允许根据选择标记基因的表达进行选择和选择标记基因的随后去除。本专利技术还涉及通过本方法制备的质粒在制备用于治疗和疫苗目的的重组蛋白、制备治疗性DNA和DNA疫苗、以及使用活细菌载体向患者递送重组蛋白和DNA中的用途。通过引用将本文涉及的所有文件并入本文。
技术介绍
·质粒是自我复制的DNA分子，其天然存在于细菌、古生菌和一些单细胞真核生物，例如酵母。近年来，质粒在生物技术产业中必不可少，可用于表达重组蛋白基因以及作为DNA治疗剂和疫苗。对于这些应用，通常修饰编码感兴趣基因的质粒，并使其在细菌宿主细胞中复制，例如大肠杆菌(Escherichia coli)。质粒通常编码抗生素抗性基因,从而能够实现抗生素选择，抗生素选择是用于鉴定转化后含有质粒的细胞，其中向生长培养基中加入的选择性抗生素能够杀死丢失质粒的细胞。然而，使用抗生素进行质粒选择和维持有多种弊端。第一，抗生素抗性基因在宿主细胞中的组成型表达对细胞产生代谢负担，这会降低细胞活力并增加质粒丢失的频率。第二，抗生素是生产过程中的额外的污染，发酵过程中的抗生素降解会降低选择压力。第三，对于DNA治疗剂和疫苗，使用抗生素抗性基因会具有在环境中转入病原体的危险，导致产生抗生素抗性病原株。当使用活细菌株作为向患者递送基因的载体时，存在急性危险。因此，需要开发出不使用抗生素抗性基因的质粒选择机制。已经发展出的备选技术需要表达的选择标记基因，例如能补充宿主染色体中缺失的拷贝的必需基因的功能拷贝。胸苷酸合酶基因thyA (McNeil et al.2000, Appl.Environ.Microbiol., 66:1216-1219)或参与二氛基庚二酸合成的 asd 基因(Degryse 1991, Mol.Gen.Genet.227:49-51)已经被用作细胞中质粒的选择基因，该细胞中的染色体基因是无功能的。该方法和抗生素选择均有相同的重要缺点:选择标记基因的存在和表达对细胞产生明显的代谢负担，并易于使质粒选择性丢失(Bentley et al.1990, Biotechnol.Bioeng.35:668-681)。已经开发出了两种更新的技术，其不需要选择标记基因的表达，因此降低细胞的代谢负担。ORT(操纵基因-阻遏蛋白滴定)利用修饰的细菌细胞，其中必需的染色体基因被置于诱导型启动子的控制下。阻遏蛋白与邻近启动子的操纵基因序列结合，阻止必需基因的表达，从而在不存在诱导剂的情况下会导致细胞死亡。当用含有操纵基因序列的多拷贝质粒转化ORT细菌细胞时，通过质粒滴定阻遏蛋白，并使必需基因表达，从而允许细胞生长并因此允许质粒选择和维持(Cranenburgh et al.2001.Nucleic Acids Res.29:e26)。另一个无选择标记基因的系统(oriSELECT)利用了 pMBl复制起点，在分子遗传学研究和开发中使用的大多数质粒中均存在pMBl复制起点。pMBl ori天然产生用来调节其拷贝数的反义RNA，修饰oriSELECT细胞，使得该RNA与对应的有义序列的mRNA相互作用，有义序列被设计在与调节必需基因的的阻遏基因或毒素基因的基因融合体中，使得细胞存活需要质粒的存在(Cranenburgh 2005，W006/003412)。这些无选择标记基因的表达系统的缺点在于，需要对微生物细胞的染色体进行遗传修饰。这些修饰在许多物种中存在技术难度，甚至在易于接受遗传操作的物种中，这些修饰耗时并且需要的工作量大。因此，仍需要开发出不含有选择标记基因且不需要对宿主细胞进行遗传修饰的质粒选择系统。专利技术描述本申请的专利技术人开发出了制备无选择标记基因的质粒的系统。在开发本系统时，本申请的专利技术人惊奇地发现，在无质粒维持系统的情况下，无选择标记基因的质粒能够在宿主细胞中维持。这个发现是意想不到的，因为在缺少质粒维持系统的情况下，本领域技术人员会预测质粒从宿主细胞中丢失。这个令人惊讶的发现可能是由于在去除选择标记基因之后，细胞内发生的代谢负担大幅降低。因此，第一方面，本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括如下步骤:a)在第一宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后在第二宿主细胞环境中培养质粒，第二宿主细胞环境能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。宿主细胞环境 术语“宿主细胞环境”包括宿主细胞本身和宿主细胞环境的条件。因此，如果质粒被从第一宿主细胞转移到第二宿主细胞或者如果宿主细胞的条件改变，则宿主细胞环境改变。在后一情况中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境是暂时分开的。通常，通过改变细胞培养的条件来改变宿主细胞中的条件。可以改变的条件包括但不限于渗透浓度、温度、是否存在诱导剂、细胞生长期和能够改变DNA的二级结构或超螺旋的化合物的存在。因此，第二方面，本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在第一宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，第一宿主细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后在第二宿主细胞中培养质粒，第二宿主细胞能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第三方面，本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在一定渗透浓度下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在所述渗透浓度下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后改变宿主细胞的渗透浓度，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第四方面，本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在一定温度下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在所述温度下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后改变宿主细胞的温度，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第五方面，本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在缺少诱导剂的条件下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在缺少诱导剂的条件下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后向宿主细胞添加诱导剂，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第六方面，本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在能改变质粒的DNA 二级结构或超螺旋的化合物的存在下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，所述化合物的存在使细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后改变细胞内化合物的水平，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第七方面，本专利技术涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在缺少能够作用于位点特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.30 GB 1011046.81.备无选择标记基因的质粒的方法，所述方法包括以下步骤: a)在第一宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，所述选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，所述第一宿主细胞环境不能实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及 b)随后在第二宿主细胞环境中培养所述质粒，所述第二宿主细胞环境能够实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除所述选择标记基因。2.按权利要求1所述的方法，还包括以下步骤: c)在细胞培养中维持所述无选择标记基因的质粒。3.按权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤: d)从所述第二宿主细胞环境分离所述无选择标记基因的质粒。4.按权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点与实现位点特异性重组所必需的附属序列在功能上相关联。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境在不同的细胞内。6.按权利要求5所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境在编码P印A、ArgR和ArcA的基因中的一个或多个中包含失活突变。7.按权利要求5或6所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含ArgR或ArcA基因和PepA基因的活性形式。8.按权利要求5所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含位点特异性重组酶。9.按权利要求7所述的方法，其中所述位点特异性重组酶是内源性位点特异性重组酶。10.按权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境在相同的宿主细胞中形成。11.按权利要求9所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境是暂时分开的。12.按权利要求9或10所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含诱导型位点特异性重组酶。13.按权利要求9-12中任一项所述的方法，其中通过改变所述细胞的温度，改变所述细胞的渗透浓度，改变所述细胞中诱导剂的水平或改变所述细胞中能改变所述质粒的二级结构或超螺旋的化合物的水平来形成所述第二宿主细胞环境。14.按权利要求8、9、12或13中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶选自Cre, Flp, R、XerC, XerD, RipX 和 CodV。15.按权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点是转座酶靶位点。16.按权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点选自Ecdif、cer、ps1、pif > mwr、Bsdif、loxP、FRT 和 RS017.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因是抗生素抗性基因。18.按权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因能允许产生在所述第一和/或第二宿主细胞环境中缺少，但又是所述第一和/或第二宿主细胞环境必需的代谢物。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是革兰氏阴性细菌细胞。20.按权利要求19所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境独立地选自埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、农杆菌属(Agrobacterium)、假...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗基·马尔科·科瑞安恩波格，马修·威廉·莱肯拜，
申请(专利权)人：科步尔生物制剂有限公司，
类型：
国别省市：