一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用，基于杆状病毒多角体蛋白的单体结构和多聚体结构的形成机制，将多角体蛋白截断为N端150aa和C端95aa，并将C端与绿色荧光蛋白融合，至于两个不同启动子下表达，构建重组型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV），该病毒可以正确形成包涵体，而且包涵体能够在荧光显微镜下发出绿色荧光。此外，将多角体蛋白的C端95aa与杆状病毒增效蛋白Enhancin或者GP37融合，可以检测到这两个蛋白在AcMNPV包涵体的大量表达，并且其杀虫活性均有显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用
本专利技术属于生物
，更具体涉及一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用。
技术介绍
为了提高杆状病毒的感染特性，可以将一些针对昆虫的毒素蛋白或者能破坏昆虫围食膜的蛋白大量包装进病毒的包涵体中，这些外源蛋白在昆虫的中肠中随着包涵体的裂解而释放，给昆虫带来除病毒外的其他致死因素，能够提高杆状病毒的杀虫效率。目前对于将外源蛋白包装进包涵体的技术主要采用Polyhedrin的截短或全长片段融合外源蛋白，通过与另外存在的野生型Polyhedrin的相互作用，而将外源蛋白包装进包涵体中(Kimetal.,Journalofmicrobiologyandbiotechnology,2005,15:710-715)。此技术存在包装效率低和遗传不稳定的缺陷(Shimetal.,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2013,79:141-149)，致使利用此技术构建的重组病毒还未能得到实际应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒，该质粒为pFastBacDual质粒的Pp10启动子下插入SEQIDNO.2所示氨基酸对应的核苷酸序列；同时其PPH启动子下插入SEQIDNO.4所示氨基酸对应的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的在于提供一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒的制备方法，方法简单。本专利技术的最后一个目的在于提供一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒在表达外源蛋白中的应用，包括可利用该质粒连接外源基因后，构建重组Acbacmid以表达抗原蛋白、病毒增效蛋白或其他外源蛋白。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒，该质粒通过将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白5’端150个氨基酸(SEQIDNO.2所示)对应的核苷酸序列插入到pFastBacDual质粒的Pp10启动子下；同时将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白3’端95个氨基酸(SEQIDNO.4所示)对应的核苷酸序列插入到PPH启动子下获得。优选的，一种可包装大量外源蛋白的重组质粒pD-PhN150-PhC95，该质粒通过将AcMNPVpolyhedrin基因的5’端的450bp(SEQIDNO.1所示)和AcMNPVpolyhedrin基因的3’端285bp(SEQIDNO.3所示)分别插入到pFastBacDual质粒Pp10启动子和PPH启动子下获得。一种可包装大量外源蛋白的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：1)AcMNPVpolyhedrin基因的5’端的450bp和3’端285bp的获得：AcMNPV基因组DNA为模板，5’端片段的引物为PHNF(CTAGCTAGCATGCCGGATTATTCATACCGTC)和PHN150R(ACATGCATGCTTAATGAGGTACATAGTCGGGGTCG)；3’端片段的引物为PHC95F(GGAATTCATGGCTAAGCGCAAGAAGGACGTGATTAGGATCGTCGAGC)和PHCR(GCTCTAGAAGATCCACCTCCACCATACGCCGGACCAGTGAAC)；2)构建重组质粒分别利用NheI/SphI酶切5’端和3’端片段，回收后的片段分别命名为PhN150和PhC95。PhN150和PhC95分别连接插入到pFastBacDual质粒Pp10启动子和PPH启动子下，酶切验证正确的载体命名为pD-PhN150-PhC95，即为本专利技术的重组质粒。一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒在表达外源蛋白中的应用，通过将外源蛋白基因连接至pD-PhN150-PhC95的PhC95的3’端，转化含有AcBacmid和Helper质粒的E.coliDH10B感受态细胞，获得重组AcBacmid，再将该重组Bacmid转染昆虫细胞即可。利用本专利技术提供的质粒，对病毒增效蛋白进行表达，可显著提高病毒的杀虫效率。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：1)由于本专利技术一分子的重构的Polyhedrin携带一分子的外源蛋白，外源蛋白的理论包埋量为100％。与以前的技术外源蛋白依靠Polyhedrin的结构随机携带外源蛋白包装入包涵体(最大包埋量为50％)相比，本专利技术提供的方法，携带外源蛋白的量具有明显的优势。2)将Polyhedrin的C端95aa与杆状病毒增效蛋白Enhancin或者GP37融合，可以检测到这两个蛋白在AcMNPV包涵体的大量表达，并且其杀虫活性分别提高了5.1～5.3和3.1～3.2倍。附图说明图1为AcMNPV多角体蛋白N端和C端分别表达重组病毒构建示意图。Pp10:AcMNPVp10启动子；PPH:AcMNPVPolyhedrin启动子；NSL:核定位信号AAGCGCAAGAAG；Ph:多角体蛋白基因。图2为vAcBac-PhN150-PhC95和vAcBac-Ph包涵体显微观察示意图。图2A为vAcBac-PhN150-PhC95；图2B为vAcBac-Ph。图3为重组病毒包涵体的SDS-PAGE检测。M:蛋白质分子量Marker；1：vAcBac-Ph；2：vAcBac-PhN150-PhC95图4为重组病毒包涵体的Westernblotting检测M:蛋白质分子量Marker；1：vAcBac-PhN150-PhC95；2：vAcBac-Ph。图5为含eGFP重组AcMNPVBacmid构建示意图Pp10:AcMNPVp10启动子；PPH:AcMNPVPolyhedrin启动子；NSL:核定位信号AAGCGCAAGAAG；L：linker(AGATCCACCTCCACC)；egfp:绿色荧光蛋白基因；Ph:多角体蛋白基因。图6A为光学显微镜下的vAcBac-PhN150-PhC95-GFP包涵体。图6B为荧光显微镜下的vAcBac-PhN150-PhC95-GFP包涵体。图7为含en4、gp37重组AcMNPVBacmid的构建示意图Pp10:AcMNPVp10启动子；PPH:AcMNPVPolyhedrin启动子；NSL:核定位信号AAGCGCAAGAAG；L：linker(AGATCCACCTCCACC)；en4:黄地老虎颗粒体病毒Enhancin基因；gp37:苹果蠹蛾颗粒体病毒gp37基因；Ph:多角体蛋白基因。图8Westernblotting检测外源蛋白的表达M:蛋白质分子量Marker；1：vAcBac-PhN150-PhC95-en4。图9Westernblotting检测外源蛋白的表达M:蛋白质分子量Marker；1：对照病毒vAcBac-Ph；2：vAcBac-PhN150-PhC95-gp37。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。含有polyhedrin全长的供体质粒pD-Ph作为阳性对照，该质粒为将AcMNPVpolyhedrin基因插入pFastBacDual质粒PP10启动子下获得。实施例1：一种可包装大量外源蛋白的重组质粒，通过以下步骤制备得到：1.AcMNPVPolyhedrinN端和C端的获得：(1)PolyhedrinN端和C端编码片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒，所述的重组质粒为pFastBac Dual质粒的P

【技术特征摘要】
1.一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒，所述的重组质粒为pFastBacDual质粒的Pp10启动子下插入SEQIDNO.2所示氨基酸对应的核苷酸序列；同时PPH启动子下插入SEQIDNO.4所示氨基酸对应的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组质粒，SEQIDNO.2对应的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；SEQIDNO.4对应的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。3.权利要求2所述的重组质粒的构建方法包括：1）AcMNPVpolyhedrin基因的5’端的450bp和3’端285bp的获得：AcMNPV基因组DNA为模板，5’端片段的引物为PHNF：CTAGCTAGCATGCCGGATTATTCATACCGTC和PHN150R：ACATGCATGCTTAATGAGGTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙修炼，赵丽娟，马瑞鹏，杨士礼，类承凤，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42