一种含G2A基因的重组质粒及构建方法技术

本发明专利技术涉及一种含G2A基因的重组质粒，包括载体片段pEGFP-N3和基因片段G2A，该重组质粒的构建方法为首先PCR扩增获得G2A基因；再将含有pEGFP-N3片段的载体与上步获得的含G2A基因的PCR产物酶切后连接；将连接产物转化受体菌；最后鉴定阳性克隆，获得pEGFP-N3-G2A连接产物。本发明专利技术成功克隆了G2A基因并构建了带有G2A基因的真核表达质粒pEGFP-N3-G2A，高效转染293T细胞并检测到G2A基因的表达，为研究G2A怎样介导动脉粥样硬化等炎症反应并探究其质子感知特性奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于真核表达载体构建领域，尤其涉及一种含G2A基因的重组质粒及构建方法。
技术介绍
孤儿G蛋白偶联受体(G2A, for G2 accumulation)是G蛋白偶联受体家族，OGRl亚家族(包括0GR1，G2A, TDAG8, GPR4)成员之一，因其能够诱导细胞停滞在G2/M期，并修复受损的DNA而得名。G2A在人类基因库RPCI-Il片段40119-35358碱基位点，编码382个氨基酸肽链，具有高度保守结构，七个疏水结构组成跨膜α螺旋(ΤΜ1-ΤΜ7)。Weng Z等1998 年鉴定得到在前B细胞和成纤维细胞G2/M检验点积累的G2A可以通过减弱BCR-ABL的转变能力来发挥抑制细胞增殖的作用，而敲除G2A基因的小鼠则表现出系统性红斑狼疮和动脉粥样硬化病变。现在普遍认为动脉粥样硬化与氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的吞噬、泡沫细胞的形成和相关细胞信号转导作用下单核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的反应有密切关系。溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)作为ox-LDL的主要脂质成分，已经有研究表明它可以与G2A高亲和力结合，介导细胞迁移，并作为分子伴侣协助G2A的表达。此外，动脉硬化病灶部位为酸性微环境，Murakami等报道，G2A的过表达在酸性环境下可导致肌醇磷酸的产生，而G2A的质子感知能力为LPC所拮抗。为进一步研究G2A怎样介导动脉粥样硬化等炎症反应，探究其质子感知特性，现有技术需要克隆G2A基因并构建真核表达载体，为下一步考察其下游细胞应答奠定基础。
技术实现思路
本专利技术提供了一种供研究G2A介导动脉粥样硬化等炎症反应并探究其质子感知特性的含有G2A基因的重组质粒。本专利技术的另外一个目的是提供了构建含有G2A基因的重组质粒的方法。概括的说，本专利技术设计了一对针对G2A基因的引物，从人脐静脉内皮细胞提取总RNA，反转录获得的cDNA中克隆不含终止密码子的G2A基因并亚克隆到pMD_19T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PEGFP-N3用Hind III和BamH I双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PEGFP-N3-G2A，并测序鉴定；重组载体以lipofectamine2000介导转染293T细胞。Real time PCR法检测外源基因在293T细胞中的表达。下面具体的说明本专利技术的详细技术方案 本专利技术的含G2A基因的重组质粒，其包括载体片段PEGFP-N3和基因片段G2A。本专利技术的G2A基因片段(不含终止密码子)来自人脐静脉内皮细胞(HUVECs )提取总RNA，反转录获得的cDNA中PCR扩增得到的；载体片段pEGFP_N3来自质粒pEGFP_N3。本专利技术的含G2A基因的重组质粒的构建方法包括如下步骤 (1)PCR扩增获得G2A基因；(2)将含有pEGFP-N3片段的载体与步骤(I)获得的含G2A基因的PCR产物酶切后连接; (3)将步骤(2)获得的连接产物转化受体菌；(4)检测外源基因在293T细胞中的表达。。进一步的说，步骤(I)包含通过PCR从HUVECs总RNA反转录得到的cDNA中获得G2A基因； 进一步的说，步骤(I)中的PCR扩增中使用PCR引物5’ -AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGAA-3’和 5’-GGATCCGCAGGACTCCTCAATCAGCC-3’ 。进一步的说，步骤(2)中所述含有pEGFP-N3的载体为质粒pEGFP_N3。进一步的说，步骤(2)中采用Η η III和I酶对含有pEGFP_N3片段的载体与 步骤(I)获得的含G2A的基因的PCR产物进行酶切。进一步的说，步骤(4)中所述检测方法为Real time PCR法。 本专利技术的有益效果在于LPC作为胞外配体能够活化G2A，激活免疫细胞内信号转导，调节T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核巨噬细胞的迁移和增殖，而LPC拮抗G2A的质子感知能力具有浓度依赖性。为了详细研究G2A在酸性刺激下的细胞应答，本专利技术克隆了 G2A基因并构建了真核表达载体pEGFP-N3-G2A质粒，用脂质体介导瞬时转染293T细胞；本专利技术发现293T细胞具有极低量的G2A基础表达。转染pEGFP-N3-G2A后，293T细胞中G2A mRNA表达量显著增加，能够满足于进一步的实验需要。本专利技术成功克隆了 G2A基因并构建了带有G2A基因的真核表达质粒PEGFP-N3-G2A,高效转染293T细胞并检测到G2A基因的表达，为下一步研究其质子感知后的信号通路奠定了基础。附图说明 图1、G2A基因的PCR扩增 图中，M表示DNA标准DL2000 ;1、2、3、4表示G2A基因扩增产物； 图2. pMD-19T-G2A的双酶切鉴定 图中，M 表示 DNA 标准 Bio Marker III ;l、pMD-19T_G2A 的 Hind III和 BamH I 双酶切产物；2、阴性对照pMD-19T的Hind III和BamH I双酶切产物； 图3. pEGFP-N3-G2A的双酶切鉴定 图中，M表示 DNA 标准 IKbp DNA ladder Marker;l、pEGFP-N3-G2A的Hindm和BamH I双酶切产物；2、阴性对照pEGFP-N3的Hind III和BamH I双酶切产物； 图 4. pEGFP-N3-G2A 表达框 图中,pUC ori为pUC复制起始位点；Kan r/Neo r卡那霉素抗性基因/新霉素抗性基因；fl ori为fl复制起始位点；HSV-tk单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；CMV IE为启动子；Hind III和BamH I为限制性内切酶；EGFP蛋白表达基因； 图5. G2A特异性定量引物PCR 图中，M表示DNA标准DL500Marker; I、G2A定量弓I物PCR产物(239bp ) 图6. GAPDH特异性定量引物PCR产物 图中，M表示DNA标准DL500Marker; I、GAPDH定量弓I物PCR产物(135bp )； 图7.转染293T细胞中G2A基因表达检测 图中，Blank为未转染细胞；pEGFP-N3为转染空载体的细胞；pEGFP-N3_G2A为转染G2A表达载体的细胞；图 8· 293Τ 细胞转染 pEGFP-N3 和 pEGFP_N3_G2A 图片(100 X) 图中， (A)普通光下观察转染pEGFP-N3载体的293T细胞照片(100X)； (B)荧光下观察转染pEGFP-N3载体的293T细胞照片(100X)； (C)普通光下观察转染pEGFP-N3-G2A载体的293T细胞照片(100X)； (D)荧光下观察转染pEGFP-N3-G2A载体的293T细胞照片(100X)。具体实施例方式 实施例I含G2A基因的重组质粒的构建方法 I、材料 1.I主要试剂 限制性内切酶 BamW I , Hind IIL DNAase I ； T4-DNA 连接酶(MBI, Fermentas)； TransStart Taq DNA Polymerase (北京全式金生物技术有限公司); dNTPs(IOmM) (Takara)； 总RNA提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含G2A基因的重组质粒，其特征在于，包括载体片段PEGFP-N3和基因片段G2A。2.如权利要求I所述的重组质粒，所述基因片段G2A是从人脐静脉内皮细胞提取总 RNA,反转录获得的cDNA中PCR扩增得到的。3.如权利要求I所述的重组质粒，所述载体片段PEGFP-N3来自质粒pEGFP_N3。4.如权利要求1-3所述的任一含G2A基因的重组质粒的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)PCR扩增获得G2A基因；2)将含有pEGFP-N3片段的载体与步骤I)获得的含G2A基因的PCR产物酶切后连接；3)将步骤2)获得的连接产物转染293T细胞；4)检测外源基因在293T细胞中的表达。5.如权利要求4所述的含G2A基因的重组质粒的构建方法，其特征在于步骤I)包含通过PCR从人脐静脉内皮细胞提取总RNA，...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿拉坦高勒，杨德志，黄旭东，冯文利，木其日，
申请(专利权)人：阿拉坦高勒，
类型：发明
国别省市：