一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗。重组质粒pET32a-epr2-3，该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn?I和EcoRI酶切位点之间插入嗜水气单胞菌的epr3基因，EcoR?I?and?Sal?I酶切位点间插入嗜水气单胞菌的epr2基因。所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗包含将转染重组质粒pET32a-epr2-3的大肠杆菌进行诱导表达所获得的重组蛋白epr2-3与佐剂。实验证明该亚单位疫苗具有较高的安全性，生产工艺简单，保存和运输条件要求不高，并且能够刺激机体全方面的免疫应答，具有广泛的开发和应用前景。

Recombinant plasmid and its preparation of Aeromonas hydrophila extracellular protease recombinant protein subunit vaccine

The invention belongs to the technical field of biology, and relates to a recombinant plasmid and a preparation of Aeromonas hydrophila extracellular protease recombinant protein subunit vaccine. The recombinant plasmid pET32a-epr2-3, the recombinant plasmid with pET32a as the starting plasmid of the Kpn? I and EcoRI restriction sites were inserted between the epr3 gene of Aeromonas hydrophila EcoR? I? And? Sal? I cleavage site between the insertion of the epr2 gene of Aeromonas hydrophila. Said subunit protein vaccine of extracellular protease recombinant protein of Aeromonas hydrophila contains the recombinant protein epr2-3 and adjuvant obtained from Escherichia coli expressing the recombinant plasmid pET32a-epr2-3 to induce expression. Experimental results show that the subunit vaccine has high safety, simple production process, storage and transportation requirements is not high, and can stimulate the immune response in all aspects, with the development and wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白 酶重组蛋白亚单位疫苗。
技术介绍
基因克隆技术已有40多年的良好应用，它包括把来自不同生物的基因同有自主 复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达， 从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。亚单位疫苗具有许多特点(1)亚单位疫苗较稳定、费用低、容易进行生产和使 用；(2)是一类新型疫苗，是将致病菌主要的保护性免疫原存在的组分制成的疫苗。(3)去 除病原体中与激发保护性免疫无关甚或有害的成分，有效地增强了疫苗的免疫原性并且减 少了副作用。嗜水气单胞菌(Ah)是我国水产养殖业的重要威胁之一，它是人、畜及水生动物共 患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中，是多种水产动物的主要致病菌，亦可引发人类 的腹泻或败血症等，对食物安全具有威胁，并且是抑制病人免疫系统功能和肝功能。该菌 的致病性与其众多的毒力因子密切相关，其中胞外蛋白酶为最常见的毒力因子之一，它具 有吞噬作用，能够刺激机体产生特异性抗体，与Ah的致病性和机体的免疫保护作用密切相 关，一直是研究嗜水气单胞菌疫苗的焦点。而利用Ah的毒力基因胞外蛋白酶制备的重组亚 单位疫苗，目前尚无相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是研制一种能够有效控制嗜水气单胞菌感染的重组亚单位疫苗，可 为嗜水气单胞菌的防控提供有力的支持。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现一种重组质粒pET32a_印r2_3，该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn I和EcoR I酶切位点之间插入嗜水气单胞菌的epr3基因，EcoR I和Sal I酶切位点间插入嗜水气单 胞菌的印r2基因，其中所述的印r3基因GenBank登录号为EU275147. I,epr2基因GenBank 登录号为CP000462. 1。所述的重组质粒pET32a-epr2_3优选通过如下方法制备得到(1 )epr2和印r3基因的克隆以保藏号为CGMCC N0. 3220的嗜水气单胞菌J-1株 的DNA为模板，分别以引物Epr2-l/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3_2通过PCR扩增，得到印r2 基因和印r3基因，将其分别插入pMD-18T质粒，得到pMD_18T_印r2和pMD_18T_印r3 ；(2)重组质粒 pET32a-epr3 的构建利用 Kpn I 和 EcoR I 对 pMD_18T_印r3 和 pET32a分别进行双酶切，将获得的epr3基因酶切产物插入pET32a的Kpn I和EcoR I酶切 位点之间，得到重组质粒pET32a-epr3 ；(3)重组质粒pET32a-印r2-3的构建利用EcoR I和Sal I对pMD_18T_印r2和 pET32a-epr3分别进行双酶切，将酶切产物印r2基因插入重组质粒pET32a_印r3的EcoR I 和Sal I酶切位点间，得到重组质粒pET32a-印r2-3。含有所述的重组质粒pET32a_印r2_3的宿主。所述的宿主优选细菌或细胞，进一步优选大肠杆菌BL21。—种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2_3,所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶 重组蛋白由所述的含有重组质粒pET32a-印r2-3的重组大肠杆菌BL21所分泌。所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2_3，优选将含有重组质粒 pET32a-印r2-3的重组大肠杆菌BL21接种于LB培养基中，振荡培养后加入0. 1M IPTG诱导 蛋白表达，继续培养后离心获得菌体，超声破碎后离心获得上清和包涵体，对包涵体进行变 性溶解，再分别取两者以His亲和层析柱纯化重组蛋白，收集所得即为重组蛋白Epr2-3。所述的重组质粒pET32a-epr2_3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单 位疫苗中的应用。所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2_3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白 酶重组蛋白亚单位疫苗中的应用。一种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗，含有所述的嗜水气单胞菌胞 外蛋白酶重组蛋白Epr2-3及佐剂。所述的佐剂优选弗氏完全佐剂或DC-Chol佐剂。有益效果本专利技术首次成功构建了表达Ah胞外蛋白酶的重组亚单位疫苗，它突破了 Ah常规 灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具弱毒疫苗的复制性和灭活疫苗的安全性，容易通过安 全性评价。试验证明，本专利技术的构建表达Ah重组亚单位疫苗所产生了针对Ah的抗体，且其抗 体滴度显著高于灭活疫苗所产生的。嗜水气单胞菌的血清型众多，灭活疫苗的免疫效果存在局限性。而胞外蛋白酶 Epr2、Epr3是不同血清型亚型Ah中最常见的毒力因子和保护性抗原。将胞外蛋白酶基因 印r2、epr3串联表达得到重组蛋白Epr2_3，能够作为致病性嗜水气单胞菌不同血清型共同 的保护性抗原，诱导动物机体产生高效价的抗体。该亚单位疫苗生产工艺简单，保存和运输 条件要求不高，且对动物无任何不良影响，不会造成细菌的扩散，是一种理想的基因工程亚 单位疫苗，在Ah的防治方面具有广阔的应用前景。附图说明图1串联表达重组质粒pET32a_epr2_3结构示意图Ori为启动子，Amp为载体pET32a上抗生素基因，epr2、epr3为目的基因，Kpnl、 EcoRI、SalI为酶切位点。图2串联表达重组质粒pET32a_印r2_3酶切检测1 DL5000DNA Marker 2 :pET32a_印r2_3 酶切产物 3 pET32a-epr2-34 DL10000DNA Marker图3重组蛋白Epr2_3的SDS蛋白电泳1 :蛋白Marker MP1022 :转化pET32a的大肠杆菌3 :转化重组质粒pET32a_印r2_3的大肠杆圍图4western blot鉴定重组蛋白Epr2_3的反应原性M :预染蛋白Marker 1 :转化重组质粒pET32a_epr2_3的大肠杆菌2 :转化pET32a 的大肠杆菌图5间接ELISA测定免疫小鼠血清的抗体滴度可以看出重组蛋白Epr2_3免疫的小鼠血清抗体效价明显高于其他组，能更好的 刺激机体产生免疫反应。图6重组蛋白与不同佐剂配合测定免疫原性弗氏完全佐剂和DC-Chol配合重组蛋白Epr2_3的疫苗对小鼠的免疫保护率高达 95%，远高于灭活组的65%。生物材料保藏信息嗜水气单胞菌J-1株，分类命名为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila,该菌株 已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地 址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC N0. 3220。具体实施例方式实施例1基因工程体——表达嗜水气单胞菌(Ah)胞外蛋白酶(EPR)的重组大肠杆 菌E. coli的构建1. epr2、epr3基因的扩增、克隆、鉴定1. 1PCR引物的设计及合成根据Ah标准毒株J-1的基因序列设计两对针对印r2 (GenBank CP000462. 1)和 epr3 (GenBank EU275147. 1)的特异性引物，在引物的5’端分别汉有限制性内切酶酶切位 点。因为由上海invitrogen生物公司合成。Epr2-1 5' -CCG GAA TTC ATG ACA CTC 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pET32a-印r2-3，其特征在于该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn I和EcoR I酶切位点之间插入嗜水气单胞菌的印r3基因，EcoR I和Sal I酶切位点间插 入嗜水气单胞菌的印r2基因，其中所述的印r3基因GenBank登录号为EU275147. 1，epr2 基因GenBank登录号为CP000462. 1。2.根据权利要求1所述的重组质粒pET32a-epr2-3,其特征在于该质粒通过如下方法 制备得到(1)epr2和epr3基因的克隆以保藏号为CGMCCN0. 3220的嗜水气单胞菌J-1株的DNA 为模板，分别以引物Epr2-l/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3_2通过PCR扩增，得到印r2基因 和印r3基因，将其分别插入pMD-18T质粒，得到pMD_18T_印r2和pMD_18T_印r3 ；(2)重组质粒pET32a-印r3的构建利用KpnI和EcoRI对pMD_18T_印r3和pET32a分 别进行双酶切，将获得的epr3基因酶切产物插入pET32a的Kpn I和EcoRI酶切位点之间， 得到重组质粒pET32a-epr3 ；(3)重组质粒pET32a-epr2-3 的构建利用 EcoRI 和 Sail 对 pMD-18T-epr2 和 pET32a-epr3分别进行双酶切，将获得的酶切产物印r2基因插入重组质粒pET32a_印r3的 EcoR I and Sa...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚火春，吴蕾，蒋亚楠，潘子豪，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：