质粒保持制造技术

本发明专利技术涉及质粒的稳定保持系统、用于该系统的宿主细胞以及采用该系统获得在医学应用上有用的质粒的方法。具体而言，本发明专利技术提供转化的宿主细胞，其包含：ｉ）抑制细胞生长的染色体基因；以及ｉｉ）编码反义序列的质粒，其中由所述质粒编码的所述反义序列抑制所述染色体基因的作用，由此允许细胞生长，并提供体内宿主细胞中质粒的稳定保持方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及质粒的稳定保持系统、用于该系统的宿主细胞以及采用该系统获得在医学应用上有用的质粒的方法。将本文引用的所有文献引入作为参考。
技术介绍
质粒通常用于重组蛋白的制备和用于基因治疗目的的DNA的制备。质粒在宿主细胞中的稳定保持对于有效制备这些产物很重要。但是，宿主细胞内携带的外源染色体DNA本身是不稳定的，因为与无质粒的细胞相比，含有该质粒的细胞增加了代谢负担。为了保持质粒稳定性和减小代谢负担，质粒经工程化以包含显性选择性标记物。在培养细胞中保持质粒的常规方法为在质粒上包括抗生素抗性基因，并在合适的抗生素存在下保持细胞。对于计划用于治疗用途的细胞或质粒来说，这具有缺点，即包含抗生素抗性基因的质粒的使用可能会促进抗生素抗性的传播。一些质粒保持的方法曾试图利用由质粒携带基因控制的自然产生的分离后杀灭机制(post segregational killing mechanism)。例如，hok/sok、srnB和pnd系统涉及由稳定mRNA编码的杀伤蛋白，该杀伤蛋白由小的不稳定反义RNA调节，其结合到杀伤RNA并使其失活。该杀伤RNA在反义RNA降解后保留在无质粒的分离物中并翻译成致命蛋白。曾在减毒的活载体疫苗菌株伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))CDV 908htr-A中研究过利用hok/sok系统的质粒保持(Galen et al，1999，Infect.Immunol，676424-6433)。但是，这种分离后杀死机制不能在转化后进行质粒筛选，因此依然依赖于质粒上的抗生素抗性基因的存在。已开发一些无抗生素筛选的用于保持和筛选质粒的备选方法，其中该质粒编码弥补宿主细胞营养缺陷的基因。例如，宿主细胞可以是突变细胞，其不能合成必需氨基酸代谢物，只有在包含编码丢失的用于合成此氨基酸的元件的质粒存在时才能在缺少此氨基酸的培养基中存活(Wang M-D et al，1987，J.Bacteriol.，1695610-5614)。但是，由于该氨基酸必需去除，这种方法限制了生长培养基的组成。可用于复杂培养基的备选方法采用具有热敏感tRNA合成酶基因的突变宿主细胞，仅在存在包含野生型tRNA合成酶基因的质粒时，该宿主细胞才能在非许可温度下存活(Skogman et al，1984，Gene 31117-122)。另一筛选方法利用质粒携带的tRNA基因弥补突变宿主细胞中必需染色体基因的无义突变(Zengel etal，1981，J.Bacteriol，145459-465)。或者，增加细胞代谢负担的基因，如pil操纵子可置于宿主染色体上，以便宿主细胞仅在编码相应阻遏蛋白的质粒存在时才能存活(Ogden et al，1992，Biotech.Bioeng.，401027-1038)。EP 0851932描述了通过操纵基因阻遏物滴定(titration)在体外培养细胞中保持质粒的方法。该方法涉及对宿主细胞的工程化，以便它包含编码阻遏物的第一染色体基因和细胞生长必需的第二染色体基因，该第二染色体基因在其控制区具有用于该阻遏物的操纵基因序列。质粒不存在时，第二染色体基因的表达由于阻遏物结合到操纵基因而被抑制，细胞死亡。将需要保持在该宿主细胞中的质粒工程化以包含操纵基因序列，以便在该质粒存在时，将阻遏物从生长必需基因滴定移除(titrated away)，该基因被表达，细胞存活。这种机制也描述于Williams et al(Nucleic AcidsResearch，1999，26(9)2120-2124)和Cranenburgh et al(Nucleic AcidResearch，2001，29(5)e26-e27)。尽管一些不依赖于抗生素筛选的质粒保持和筛选机制已公知，考虑到质粒在生产用于治疗应用的DNA和重组蛋白方面的日益增加的重要性，人们仍然需要开发其它的方法。此外，到目前为止开发的质粒保持和筛选系统需要使用为应用于这些系统而经特别修饰的质粒。人们依然需要这样的质粒保持和筛选系统，即其不涉及抗生素抗性且采用本领域普通的质粒而无需特别修饰。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，提供转化的宿主细胞，其包含 i)抑制细胞生长的染色体基因；以及ii)编码反义序列的质粒，其中由该质粒编码的所述反义序列抑制所述染色体基因的作用，由此允许细胞生长。优选地，由所述质粒编码的反义序列是由质粒的复制起点编码，但它也可由该质粒的其它区域编码。本专利技术使用的术语“反义序列”指基本上互补于其靶序列并能够特异地与该靶序列杂交的核酸序列。优选地，由质粒编码的反义序列在严紧条件下杂交到其靶序列。高严紧杂交条件定义为在包含50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中42℃孵育过夜，随后在0.1X SSC中在约65℃清洗滤器。本专利技术使用的“细胞生长”指培养基中的细胞数量随时间增加和指细胞存活，其中活细胞的数量不随时间减少。“抑制细胞生长”的含义是指染色体基因对细胞是致命的，以致培养基中活细胞的数量随时间减少，或其阻止细胞生长，以致培养基中活细胞的数量不随时间增加。根据本专利技术的该第一方面，转化宿主细胞的生长依赖于质粒的存在，导致对保持质粒的细胞的筛选。如果质粒从宿主细胞丢失，则染色体基因的作用将不再被质粒编码的反义序列阻止，细胞生长将被抑制。在一些实施方案中，只需单拷贝的质粒就可抑制染色体基因的表达，从而允许细胞生长。在其它实施方案中，可能需要多拷贝的质粒存在以抑制染色体基因的表达。染色体基因可直接抑制细胞生长。例如，染色体基因的转录和翻译可产生对细胞致命的如毒素(toxin)的蛋白质。或者，染色体基因可间接抑制细胞生长。例如，染色体基因的转录和翻译可产生阻遏蛋白，其抑制第二染色体基因编码的对细胞生长必需的蛋白质的转录和翻译。染色体基因的转录还可产生反义序列，其结合到第二染色体基因或结合到从该第二染色体基因转录的mRNA而抑制对细胞生长必需的该第二染色体基因的转录和/或翻译。在一些实施方案中，染色体基因可通过更复杂的级联反应抑制细胞生长。例如，染色体基因可编码活化蛋白，该活化蛋白激活第二染色体基因的表达，该第二染色体基因接着编码阻遏蛋白，该阻遏蛋白抑制编码对细胞生长必需的蛋白的第三染色体基因的表达。或者，第一染色体基因可编码第二染色体基因的反义抑制物，该第二染色体基因接着编码阻遏蛋白，该阻遏蛋白阻遏编码抑制细胞生长的蛋白的第三染色体基因的表达。这类级联可包括超过三个染色体基因。例如，它们可包括4、5、6、7或更多的染色体基因。在所有的这些级联中，缺少对第一染色体基因抑制的质粒导致第一染色体基因引发级联反应，该级联反应最终导致细胞生长的抑制。本专利技术提供适合的抑制细胞生长的染色体基因例子。本专利技术的转化宿主细胞优选用于保持治疗用途的质粒。由此，质粒优选包括用于插入目的基因的克隆位点。优选地，质粒还包括目的基因。所述目的基因优选可在哺乳动物细胞中、优选人细胞中表达。所述目的基因可表达用于治疗用途的目的RNA或目的蛋白。本领域已知且本专利技术提供可包括在质粒上的这类目的基因的例子。通过结合到染色体本文档来自技高网...

【技术保护点】
转化的宿主细胞，其包含　　　　ｉ）抑制细胞生长的染色体基因；以及　　　　ｉｉ）编码反义序列的质粒，　　　　其中由所述质粒编码的所述反义序列抑制所述染色体基因的作用，由此允许细胞生长。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗基马尔科科瑞安恩波格，
申请(专利权)人：科步尔生物制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]