棒状链霉菌ｌａｔ基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法，属于生物工程，涉及棒状链霉菌编码赖氨酸ε－转氨酶ｌａｔ基因的ＰＣＲ体外扩增引物及ｌａｔ基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法。本发明专利技术设计了上下游引物，实现ｌａｔ基因的体外大量扩增，构建了具有单交换整合能力的质粒和衍生物，对影响克拉维酸产量的棒状链霉菌的ｌａｔ基因进行缺失突变，并完成在大肠杆菌中的构建工作。该质粒大小约为７．８ｋｂ或７．０ｋｂ，它包含来自棒状链霉菌中的编码赖氨酸ε－转氨酶基因的一部分及大肠杆菌源质粒和链霉菌源质粒的复制起始点、带有在大肠杆菌和链霉菌中都可表达的阿泊拉霉素抗性选择标记，并具有ｐＳＷ３４４Ｅ温敏型复制子基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，涉及一种用基因工程技术实现棒状链霉菌编码赖氨酸ε转氨酶lat基因的PCR体外扩增引物及lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法。
技术介绍
自青霉素问世以来，β-内酰胺类抗生素至今已被广泛应用，许多具有新特点的β-内酰胺类品种不断问世。但是，随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用，各种细菌对这一类抗生素的耐药性也日趋增多。细菌耐药机制有多种，其中产生β-内酰胺酶是最主要的耐药机制，因此开发β-内酰胺酶抑制剂对于解决细菌的耐药性问题具有重要意义。这类酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联合应用，通过β-内酰胺酶抑制剂灭活β-内酰胺酶，而使β-内酰胺类抗生素发挥原有的抗菌作用。克拉维酸是第一个被发现并应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂，因其由棒状链霉菌代谢合成，故又名棒酸。棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)是一种广为人知的克拉维酸产生菌。它的抗菌作用微弱，但是具有较好的抑酶作用。克拉维酸对金黄色葡萄球菌产生的β-内酰胺酶，革兰阴性菌产生的质粒介导酶(TEM和SHV等)以及克雷伯杆菌属，普通变形杆菌、脆弱拟杆菌产生的染色体酶均有抑制作用。阿莫西林与克拉维酸合用的体外抗菌研究发现，克拉维酸提高阿莫西林对克雷伯杆菌属、普通变形杆菌等少数肠道产酶杆菌等的抗菌作用4-32倍，对嗜血流感杆菌的抗菌活性提高32倍。克拉维酸这种非常功效，决定了其需求量很大，因此有关提高棒状链霉菌克拉维酸产量的方法是国内外研究的热点领域。国内提高克拉维酸产量的途径主要是优化发酵条件，但其所能提高的产量有限。对棒状链霉菌进行原生质体再生以及传统的紫外诱变法筛选高产菌株虽然仍是菌种改良的主要手段，但是存在选育周期长、效率低以及盲目性、随机性等问题尚有待解决。由于克拉维酸发酵产量低，生产工艺复杂，化学合成法尚未实现工业化，我国的克拉维酸制剂一直以来主要依赖进口，因此大幅度提高其生产菌株产酸量是当前克拉维酸开发中的一项重要任务。目前利用基因工程的方法提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究在国内尚属空白。国外对棒状链霉菌克拉维酸合成基因簇的研究较多，棒状链霉菌克拉维酸合成的途径已基本明确，为利用基因工程的方法提高克拉维酸的产量提供了可能。由于克拉维酸的生物合成通常受基因的调控，因此棒状链霉菌该基因的突变对克拉维酸产率的影响就显得十分重要。从影响棒状链霉菌克拉维酸代谢的lat基因入手，将与克拉维酸代谢支路平行的另一条代谢支路中编码某种酶的基因突变，从而阻断该代谢支路进而可提高克拉维酸产量。棒状链霉菌合成头孢霉素C的代谢途径是以L-赖氨酸、L-半胱氨酸和缬氨酸为前体物质的(见图5)，编码头孢霉素C合成途径的酶的基因簇现已经明确，棒状链霉菌的lat基因编码赖氨酸ε-转氨酶，是头孢霉素C合成的第一个基因，尽管头孢霉素C和克拉维酸的合成途径不受相同的酶催化，但编码与克拉维酸合成相关酶的基因簇紧挨编码与头孢霉素C合成相关酶的基因簇，且两条代谢途径受相同的调节蛋白CcaR和ClaR的调控，因此，头孢霉素C合成的停止将有效提高克拉维酸的产量，也是进行调控的首选基因，该酶的失活将导致头孢霉素C合成的停止，因此，目的性的对lat基因进行突变将使头孢霉素C合成途径受阻，进而可以有效提高克拉维酸的产量。Paradkar等人曾采用基因置换的方法对棒状链霉菌的lat基因进行了插入突变，使克拉维酸产量得到提高。其实验的主要思路是，首先将棒状链霉菌的lat基因插入大肠杆菌质粒pUC119的多克隆位点，然后对插入的lat基因进行单酶切，与末端经过修饰的阿泊拉霉素抗性基因连接，使lat基因中插入一段阿泊拉霉素抗性基因，经双酶切将插入抗性基因的lat基因(lat∷apr)片段，末端修饰后与大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体pIJ486相连接，得到lat基因插入突变的重组质粒。用在大肠杆菌中构建好的该质粒转化原始克拉维酸产生菌后，质粒与链霉菌的染色体通过双交换发生同源重组，从而实现对棒状链霉菌的lat基因进行突变。但是，由于其采用的插入突变方法步骤相对较繁琐，且所用的穿梭质粒载体pIJ486，不具有单交换整合到染色体的能力，而双交换整合势必具有一定难度。但是，对棒状链霉菌的lat基因进行缺失突变，并选用具有单交换整合能力的穿梭质粒载体构建lat基因突变的质粒目前未见报道。
技术实现思路
要解决的问题针对上述情况，本专利技术的目的在于采用基因工程的技术，设计了两条用于PCR扩增棒状链霉菌编码赖氨酸ε-转氨酶lat基因的上下游引物，实现了lat基因的体外大量扩增，并对影响克拉维酸产量的棒状链霉菌的lat基因进行缺失突变，构建了用于转化棒状链霉菌进而实现对棒状链霉菌lat基因阻断的具有单交换整合能力的两种缺失质粒pKCLES、pKCLHS和衍生物，并完成在大肠杆菌中的构建工作。技术方案本专利技术首先对棒状链霉菌的lat基因进行了PCR体外扩增，并将扩增后的lat基因末端经修饰后克隆到大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体pKC1139的多克隆位点(MCS)，经双酶切去除lat基因中一段EcoRI-ScaI片段或HindIII-ScaI片段后分别自连构建成重组质粒pKCLES和pKCLHS，两种重组质粒均为松弛型质粒。本专利技术构建的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒及其衍生物，包含棒状链霉菌中编码赖氨酸ε-转氨酶基因的一部分，质粒上还包含了大肠杆菌源质粒和链霉菌源质粒的复制起始点、带有在大肠杆菌和链霉菌中都可表达的阿泊拉霉素抗性选择标记，并具有pSW344E温敏型复制子基因。上述棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)来自于中国抗生素微生物菌种保藏中心保藏号为CACC NO.SIIA 2.111。需要说明的是所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒，pKCLHS大小约为7.8kb，并且由图1的限制图谱表示；质粒pKCLES大小约为7.0kb，并且由图2的限制图谱表示。所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒pKCLHS和pKCLES的衍生物大小为除7.0kb、7.8kb之外的6.5kb-8.3kb。棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒pKCLHS、pKCLES及其衍生物的构建方法质粒pKCLHS和pKCLES的构建方法首先构建含有目的基因lat的重组质粒pUCm-T-lat，通过设计引物并进行PCR体外扩增，得到大小约为1.8kb的lat基因片段，选用具有多克隆位点的pUCm-T载体与纯化后的lat基因片段以T4DNA连接酶进行连接得到重组质粒pUCm-T-lat；用EcoRI-HindIII双酶切pUCm-T-lat，得到的lat基因片段经纯化后与经EcoRI-HindIII双酶切并纯化后的载体pKC1139以T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pKC1139-lat；pKC1139-lat分别经HindIII-ScaI或EcoRI-ScaI双酶切回收约7.8kb或7.0kb的DNA片段，两种纯化后的回收产物首先均以T4DNA聚合酶补平末端，再以T4DNA连接本文档来自技高网...
【技术保护点】
棒状链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）ｌａｔ基因缺失的质粒、衍生物，其特征在于该质粒或其衍生物包含棒状链霉菌中的编码赖氨酸ε－转氨酶基因的一部分，质粒上包含大肠杆菌源质粒和链霉菌源质粒的复制起始点，为带有在大肠杆 菌和链霉菌中都可表达的阿泊拉霉素抗性选择标记的穿梭质粒，并具有ｐＳＷ３４４Ｅ温敏型复制子基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王艳萍，左志晗，金守光，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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