【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵工程，尤其是一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
1、多巴胺（dopamine）是内源性含氮有机化合物，简称da，是儿茶酚胺类的一种，分子式为c8h11no2，为酪氨酸（芳香族氨基酸）在代谢过程中产生的中间产物。多巴胺系统调节障碍则会导致帕金森病、精神分裂症、注意力缺陷多动综合征和垂体肿瘤等疾病的发生，此外，多巴胺还常被用于治疗多种类型的休克病症。
2、不仅如此，以多巴胺为原料，还可生产如羟基酪醇、红景天苷等高附加值产品，具有非常良好的市场前景。
3、目前多巴胺的合成方法还是主要集中在化学合成法，如用胡椒乙胺一步水解，或者使用香兰素进行一系列化学反应合成多巴胺。但是由于化学合成法反应复杂，成本高昂且部分原料具有毒性，目前急需一种更加绿色、安全、廉价的多巴胺合成方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种多巴胺生产菌株。
2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述多巴胺生产菌株的构建方法。
3、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述多巴胺生产菌株的应用。
4、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
5、一种质粒，为质粒pet-da02，其核苷酸序列如序列表seq id no.18所示。
6、优选的，上述质粒，携带复制起始位点、卡那霉素抗性基因、trc启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于drosophila melanogast
7、一种多巴胺生产菌株，为多巴胺基因工程菌da-14，是在 e.coli w3110的基础上进行代谢工程改造获得的，缺失了tyna、tyrr、pykf基因，上调了arogfbr、aroe、tyrafbr、tyrb、arop、pdxj、pdxh基因，异源表达了来源于corynebacterium glutamicum 的cg0898基因以及serratia rubidaea的hpabc基因，同时携带了上述质粒pet-da02，所述质粒pet-da02异源表达了来源于drosophila melanogaster的dmddc基因。
8、优选的，上述多巴胺生产菌株，以 e.coli w3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的tyna、tyrr、pykf基因；利用trc启动子强化来源于arogfbr基因转录，并整合到基因组ygay基因位点；利用trc启动子强化aroe基因转录强度，并整合到基因组ycgh基因位点；利用trc启动子强化tyrafbr基因转录强度，并整合到基因组yeep基因位点；利用trc启动子强化tyrb基因转录强度，并整合到基因组yeel基因位点；利用trc启动子强化arop基因转录强度，并整合到基因组yjip基因位点；利用trc启动子强化pdxj基因转录强度，并整合到基因组rph基因位点；利用trc启动子强化pdxh基因转录强度，并整合到基因组yciq基因位点；利用trc启动子强化cg0898基因转录强度，并整合到基因组yjgx基因位点；利用trc启动子强化hpabc基因转录强度，并整合到基因组ylbe基因位点；利用trc启动子强化hpabc基因转录强度，并整合到基因组ycdn基因位点。
9、优选的，上述多巴胺生产菌株，是在 e.coli w3110的基础上进行代谢工程改造获得的，具体为：利用crispr-cas9基因编辑技术，在基因组上敲除伯胺氧化酶tyna；在基因组上敲除转录调节因子基因tyrr；在基因组上敲除丙酮酸激酶基因pykf；在基因组ygay位点上整合dahp合成酶基因arogfbr；在基因组ycgh位点整合莽草酸脱氢酶基因aroe；在基因组yeep位点上整合预苯酸脱氢酶基因tyrafbr；在基因组yeel位点上整合芳香族氨基转移酶基因tyrb；在基因组yjip位点上整合芳香族氨基酸转运蛋白基因arop；在基因组rph位点上整合吡哆醇-5-磷酸合酶基因pdxj；在基因组yciq位点上整合吡哆醇 5'-磷酸氧化酶基因pdxh；在基因组yjgx位点上整合吡哆醛 5'-磷酸合酶基因cg0898；在基因组ylbe位点上整合4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc；在基因组ycdn位点上整合4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc，对其进行双拷贝表达；在pet-28a(+)质粒的基础上敲除其上的laci基因构建pet-da01质粒，在pet-da01质粒的基础导入来源于果蝇的多巴脱羧酶基因dmddc构建pet-da02质粒。
10、优选的，上述多巴胺生产菌株，所述 e.coliw3110为 e.coliw3110 atcc 27325。
11、优选的，上述多巴胺生产菌株，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq idno.1所示； tyna基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；tyrr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；pykf基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；arogfbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示；aroe基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示；tyrafbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示；tyrb基因的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示；arop基因的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示；pdxj基因的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示；pdxh基因的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示；cg0898基因的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示；hpabc基因的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示。
12、优选的，上述多巴胺生产菌株，所述质粒pet-da02携带的终止子（terminator）的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；laci基因的核苷酸序列如序列表seq id no.15所示；dmddc基因的核苷酸序列如序列表seq id no.16所示；质粒pet-da01的核苷酸序列如序列表seq id no.17所示；质粒pet-da02的核苷酸序列如序列表seq id no.18所示。
13、上述多巴胺生产菌株的构建方法，在出发菌株e.coliw3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
14、(1)底盘菌改造：以e.coli w3110为出发菌株，敲除了tyna、tyrr、pykf基因，上调了arogfbr、aroe、tyrafbr、tyrb、arop基因，异源表达了来源于serratia rubidaea的hpabc基因；
15、（2）优化辅因子供给系统：因为多巴脱羧酶具有plp依赖性，因此加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种质粒，其特征在于：为质粒PET-DA02，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示。
2.一种多巴胺生产菌株，其特征在于：为多巴胺基因工程菌DA-14，是在E.coli W3110的基础上进行代谢工程改造获得的，缺失了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP、pdxJ、pdxH基因，异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum 的cg0898基因以及Serratia rubidaea的hpaBC基因，同时携带了权利要求1所述质粒PET-DA02，所述质粒PET-DA02异源表达了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因。
3.根据权利要求2所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的tynA、tyrR、pykF基因；利用trc启动子强化来源于aroGfbr基因转录，并整合到基因组ygaY基因位点；利用trc启动子强化aroE基因转录强度，并整合到基因组ycgh基因位点；利用trc启
4.根据权利要求2或3所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述E.coliW3110为E.coliW3110 ATCC 27325。
5.根据权利要求3所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示； tynA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；tyrR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；pykF基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；aroGfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；aroE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；tyrAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；tyrB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；aroP基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；pdxJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；pdxH基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.12所示；Cg0898基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示；hpaBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。
6.根据权利要求2所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述质粒PET-DA02携带的终止子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；DmDdc基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.16所示。
7.权利要求2-6之一所述多巴胺生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
8.权利要求2-6之一所述多巴胺生产菌株在发酵生产多巴胺方面的应用。
9.根据权利要求8所述的多巴胺生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
10.根据权利要求9所述的多巴胺生产菌株的应用，其特征在于：所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母3 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸1.5 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5 g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MgSO4·7H2O 10 mg/L，其余为水；所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉3.5g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸2 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，其余为水。
...【技术特征摘要】
1.一种质粒，其特征在于：为质粒pet-da02，其核苷酸序列如序列表seq id no.18所示。
2.一种多巴胺生产菌株，其特征在于：为多巴胺基因工程菌da-14，是在e.coli w3110的基础上进行代谢工程改造获得的，缺失了tyna、tyrr、pykf基因，上调了arogfbr、aroe、tyrafbr、tyrb、arop、pdxj、pdxh基因，异源表达了来源于corynebacterium glutamicum 的cg0898基因以及serratia rubidaea的hpabc基因，同时携带了权利要求1所述质粒pet-da02，所述质粒pet-da02异源表达了来源于drosophila melanogaster的dmddc基因。
3.根据权利要求2所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：以e.coli w3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的tyna、tyrr、pykf基因；利用trc启动子强化来源于arogfbr基因转录，并整合到基因组ygay基因位点；利用trc启动子强化aroe基因转录强度，并整合到基因组ycgh基因位点；利用trc启动子强化tyrafbr基因转录强度，并整合到基因组yeep基因位点；利用trc启动子强化tyrb基因转录强度，并整合到基因组yeel基因位点；利用trc启动子强化arop基因转录强度，并整合到基因组yjip基因位点；利用trc启动子强化pdxj基因转录强度，并整合到基因组rph基因位点；利用trc启动子强化pdxh基因转录强度，并整合到基因组yciq基因位点；利用trc启动子强化cg0898基因转录强度，并整合到基因组yjgx基因位点；利用trc启动子强化hpabc基因转录强度，并整合到基因组ylbe基因位点；利用trc启动子强化hpabc基因转录强度，并整合到基因组ycdn基因位点。
4.根据权利要求2或3所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述e.coliw3110为e.coliw3110 atcc 27325。
5.根据权利要求3所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示； tyna基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；tyr...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，李旭，姜文静，刘韪玮，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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