【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及高效制备氢化可的松的蓝色犁头霉菌种及其构建方法。
技术介绍
1、氢化可的松是目前产量最大的糖皮质激素，也是合成其他糖皮质激素的核心中间体。
2、国内工业上主要利用蓝色犁头霉(absidia coerulea)以11-脱氧皮质醇为底物，在c11β位引入羟基合成氢化可的松(过程如图1)，但现有的生产工艺氢化可的松投料量低，副产物多，得率只有42-45％，严重制约了产业的转型升级。
3、蓝色犁头霉c11β-羟化反应是糖皮质激素规模化生产所依赖的关键反应技术，而甾体c11羟基化效率在很大的程度上取决于生产菌种的c11β-羟化酶活性。为了解决目前的工业生产应用问题，需对酶分子进行定向改造。
4、目前常用酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)作为c11β-羟化酶的表达宿主，该方法在酶分子改造中具有易进行基因操作、易筛选等优势，但在制备氢化可的松的过程中具有投料量低，转化速率较慢等缺点。相比之下，蓝色犁头霉本身具有良好的甾体羟化活性，经crispr-cas9技术改造后更适合作为c11β-羟化酶突变体宿主。
5、从构巢曲霉(aspergillus nidulans)基因组文库中分离出来的ama1序列能够提高转化频率并在丝状真菌中产生表型不稳定的转化体。本专利技术利用含有ama1序列的质粒载体使目的基因能够高效地转化进蓝色犁头霉原生质体。
技术实现思路
1、实验室前期构建的具有高羟化特异性的c11β
2、本专利技术的技术路线如下：实验室前期鉴定了蓝色犁头霉的c11β-羟化酶基因cyp5311b2，通过半理性设计和定点突变技术对其进行定向改造，获得了具有高羟化特异性的突变体t329a以及重组酿酒酵母菌株。为了进一步提高投料量，改进工艺效率，本专利技术通过crispr-cas9编辑得到cyp5311b2功能缺失的蓝色犁头霉，再通过crispr-cas9编辑将c11β-羟化酶基因cyp5311b2 t329a替换功能缺失的蓝色犁头霉中cyp5311b1基因，获得了一种工业高效制备氢化可的松的蓝色犁头霉重组菌，为c11β-羟化工艺提供了借鉴。其中，羟化酶基因cyp5311b2 t329a受蓝色犁头霉基因cyp5311b1的orf上游800bp序列启动子的驱动；利用crispr-cas9技术获得cyp5311b2功能缺失的蓝色犁头霉宿主菌步骤如下：
3、(1)确定cas9靶向的cyp5311b2基因序列；
4、(2)构建含有两个grna表达盒、一个cas9表达盒以及ama1序列的表达载体pama1-grna-1-2-cas9；
5、(3)将(2)中重组表达载体利用原生质体转化法导入野生蓝色犁头霉进行基因编辑；
6、(4)获得的转化子提取基因组进行测序验证，得到c11β-羟化酶基因cyp5311b2缺失的蓝色犁头霉宿主菌；
7、(5)转化子转接至无抗pda试管中培养至产孢，利用无菌水洗涤孢子，稀释涂板；
8、(6)菌落长出后，将菌落同时依次对点至潮霉素b 300mg/ml及无抗pda平板筛选得到c11β-羟化酶基因cyp5311b2缺失且丢掉pama1-grna-1-2-cas9载体的蓝色犁头霉宿主菌。
9、本专利技术所述的蓝色犁头霉c11β-羟化酶突变体基因cyp5311b2 t329a的核苷酸序列如seq id no.1所示，以上序列属于本专利技术保护范围。
10、利用本专利技术所述的编码c11β-羟化酶的基因片段cyp5311b2 t329a所构建的重组表达载体、重组表达质粒或宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，所使用的扩增引物序列也属于本专利技术的保护范围。
11、本专利技术所述采用半理性设计和定点突变技术获得的突变体基因cyp5311b2 t329a编码的甾体化合物羟化酶包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母、蓝色犁头霉等宿主细胞内表达。
12、有益效果：本专利技术利用crispr-cas9技术对野生蓝色犁头霉进行改造，获得了c11β-羟化酶基因cyp5311b2失活的蓝色犁头霉宿主菌，再通过crispr-cas9技术得到高效制备氢化可的松的重组蓝色犁头霉。重组蓝色犁头霉羟化特异性提高且投料量达4g/l，本专利技术研究成果具有很好的工业应用价值。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一株重组蓝色犁头霉，其特征在于，利用CRISPR-Cas9技术获得C11β-羟化酶基因CYP5311B2失活的蓝色犁头霉，并将SEQ ID NO.1所示的CYP5103B2 T329A突变体核苷酸序列整合到功能缺失的蓝色犁头霉基因组中，获得了一种工业高效制备氢化可的松的蓝色犁头霉重组菌。
2.根据权利要求1所述的C11β-羟化酶基因CYP5311B2失活的蓝色犁头霉，其特征在于，构建步骤如下：
3.根据权利要求1所述的CYP5311B2 T329A突变体核苷酸序列，其特征在于，受蓝色犁头霉基因CYP5311B1的ORF上游800bp序列启动子的驱动。
4.根据权利要求1所述的CYP5103B2 T329A突变体核苷酸序列整合到功能缺失的蓝色犁头霉基因组中，其特征在于，利用CRISPR-Cas9技术，CYP5103B2 T329A替换C11β-羟化功能缺失的蓝色犁头霉的CYP5311B1基因，用于替换的目的基因片段上下游均含有同源臂。
5.根据权利要求1所述的重组蓝色犁头霉，其特征在于，所述重组蓝色犁头霉可催化11-脱氧皮质醇生成
...【技术特征摘要】
1.一株重组蓝色犁头霉，其特征在于，利用crispr-cas9技术获得c11β-羟化酶基因cyp5311b2失活的蓝色犁头霉，并将seq id no.1所示的cyp5103b2 t329a突变体核苷酸序列整合到功能缺失的蓝色犁头霉基因组中，获得了一种工业高效制备氢化可的松的蓝色犁头霉重组菌。
2.根据权利要求1所述的c11β-羟化酶基因cyp5311b2失活的蓝色犁头霉，其特征在于，构建步骤如下：
3.根据权利要求1所述的cyp5311b2 t329a突变体核苷酸序列，其特征在于，受蓝色犁头霉基因cyp5311b1的o...
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