【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及到一种弗氏柠檬酸杆菌的lamp检测引物组合及可视化lamp检测方法。
技术介绍
1、弗氏柠檬酸杆菌是一种典型的人-畜-鱼共患病条件性致病菌，动物和人均可感染致病性弗氏柠檬酸杆菌而发生腹泻、食物中毒和继发感染。近年来，弗氏柠檬酸杆菌引起动物致病的报道较多且常引起动物败血症甚至急性死亡，先后有弗氏柠檬酸杆菌导致大西洋鲑(salmo salar)、虹鳟(oncorhynchus mykiss)、乌鳢(channa argus)、锦鲤(cyprinuscarpio)、斑马鱼(danio rerio)、中华鲟(acipenser sinensis)、河蟹(eriocheirsinensis)、红螯螯虾(cherax quadricarinatus)、小龙虾(procambarus clarkii)发病的报道。弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)感染引起的水产动物疾病频繁暴发，给水产养殖业造成巨大损失，因此早期检测对于有效防控病原感染及减少因感染造成的经济损失至关重要。
2、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是一种新型核酸扩增技术，lamp方法和pcr反应相比，其优点在于不需要进行反复热变性和反复升降温这样繁琐且时间较长的操作过程，反应体系置于恒温条件下就可进行持续的快速扩增，经济、便捷，且反应体系稳定可靠。针对基因的六个位点进行识别，使其具有很高的灵敏性和特异性，并且能够快速检测病原，不受污染样品和干
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
3、因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种弗氏柠檬酸杆菌的lamp检测引物组合。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种弗氏柠檬酸杆菌的lamp检测引物组合，其特征在于：由正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip组成；各引物序列如下：
5、f3：5＇-cgacactggtgtatcccca-3＇；
6、b3：5＇-ccggagcaacaactactgg-3＇；
7、fip：
8、5＇-tcaccgatgttgttggtccact-tggtggcgtagagtatgca-3＇；
9、bip：5＇-cgaacaccgttggtggtcgt-ttcttcctgctggccgaa-3＇。
10、作为本专利技术所述lamp检测引物组合的一种优选方案，其中：所述lamp检测引物组合在检测弗氏柠檬酸杆菌中的应用。
11、本专利技术的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种检测弗氏柠檬酸杆菌的lamp试剂盒，其特征在于：包含25μl检测溶液，所述的检测溶液包括：10μm正向外引物f3、10μm反向外引物b3、100μm正向内引物fip、100μm反向内引物bip、10x thermopol buffer、5m甜菜碱、模板dna、8u/μlbst聚合酶、10mm dntps、100mm硫酸镁、depc水；
12、其中，各引物序列具体如下：
13、f3：5＇-cgacactggtgtatcccca-3＇；
14、b3：5＇-ccggagcaacaactactgg-3＇；
15、fip：
16、5＇-tcaccgatgttgttggtccact-tggtggcgtagagtatgca-3＇；
17、bip：5＇-cgaacaccgttggtggtcgt-ttcttcctgctggccgaa-3＇。
18、本专利技术的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种如上述的lamp试剂盒用于检测弗氏柠檬酸杆菌的可视化lamp检测方法，其特征在于：包括，
19、取10μm正向外引物f31.0μl、10μm反向外引物b31.0μl、100μm正向内引物fip 0.1μl、100μm反向内引物bip 0.1μl、10x thermopol buffer 2.5μl、5m甜菜碱5.0μl、模板dna1.0μl、8u/μlbst聚合酶1.0μl、10mm dntps3.0μl、100mm硫酸镁1.0μl，最后加depc水至25.0μl进行lamp反应，反应条件为65℃下保持55min，之后85℃终止反应5min，观察扩增产物。
20、作为本专利技术所述lamp检测方法的一种优选方案，其中：所述观察扩增产物，其中，弗氏柠檬酸杆菌可扩增出阶梯状条带。
21、本专利技术的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种如上述的lamp试剂盒用于检测弗氏柠檬酸杆菌的可视化lamp检测方法，其特征在于：包括，
22、取10μm正向外引物f31.0μl、10μm反向外引物b31.0μl、100μm正向内引物fip 0.1μl、100μm反向内引物bip 0.1μl、10x thermopol buffer 2.5μl、5m甜菜碱5.0μl、模板dna1.0μl、8u/μlbst聚合酶1.0μl、10mm dntps3.0μl、100mm硫酸镁1.0μl，羟基奈酚蓝hnb 2.0μl，最后加depc水至25.0μl进行lamp反应，反应条件为65℃下保持55min，之后85℃终止反应5min，观察扩增产物颜色。
23、作为本专利技术所述lamp检测方法的一种优选方案，其中：所述观察扩增产物颜色，其中，显示蓝色并且随反应时间蓝色逐渐加深为阳性，样品中存在弗氏柠檬酸杆菌；显示紫色为阴性，样品中不存在弗氏柠檬酸杆菌。
24、本专利技术有益效果：
25、本专利技术以弗氏柠檬酸杆菌ompa基因为检测靶标设计特异性的环介导等温扩增引物,以弗氏柠檬酸杆菌dna为模板，建立lamp检测反应体系，开展特异性和灵敏度验证，借助羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,hnb)染料指示剂即可进行结果的可视化判定，建立了一种用于弗氏柠檬酸杆菌快速检测的特异性强、灵敏度高、操作简便、结果可靠的可视化lamp检测方法。相比传统pcr技术，本专利技术无需昂贵的仪器，可用肉眼直接观察检测结果，是一种更适合现场、基层快速检测的方法。
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1.一种弗氏柠檬酸杆菌的LAMP检测引物组合，其特征在于：由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成；各引物序列如下：
2.如权利要求1所述的LAMP检测引物组合在检测弗氏柠檬酸杆菌中的应用。
3.一种检测弗氏柠檬酸杆菌的LAMP试剂盒，其特征在于：包含25μL检测溶液，所述的检测溶液包括：10μM正向外引物F3、10μM反向外引物B3、100μM正向内引物FIP、100μM反向内引物BIP、10x ThermoPol Buffer、5M甜菜碱、模板DNA、8U/μL Bst聚合酶、10mM dNTPs、100mM硫酸镁、DEPC水；
4.如权利要求3所述的LAMP试剂盒在检测弗氏柠檬酸杆菌中的应用。
5.如权利要求3所述的LAMP试剂盒用于检测弗氏柠檬酸杆菌的LAMP检测方法，其特征在于：包括，
6.如权利要求5所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述观察扩增产物，其中，弗氏柠檬酸杆菌可扩增出阶梯状条带。
7.如权利要求3所述的LAMP试剂盒用于检测弗氏柠檬酸杆菌的可视化LAM
8.如权利要求7所述的可视化LAMP检测方法，其特征在于：所述观察扩增产物颜色，其中，显示蓝色并且随反应时间蓝色逐渐加深为阳性，样品中存在弗氏柠檬酸杆菌；显示紫色为阴性，样品中不存在弗氏柠檬酸杆菌。
...【技术特征摘要】
1.一种弗氏柠檬酸杆菌的lamp检测引物组合，其特征在于：由正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip组成；各引物序列如下：
2.如权利要求1所述的lamp检测引物组合在检测弗氏柠檬酸杆菌中的应用。
3.一种检测弗氏柠檬酸杆菌的lamp试剂盒，其特征在于：包含25μl检测溶液，所述的检测溶液包括：10μm正向外引物f3、10μm反向外引物b3、100μm正向内引物fip、100μm反向内引物bip、10x thermopol buffer、5m甜菜碱、模板dna、8u/μl bst聚合酶、10mm dntps、100mm硫酸镁、depc水；
4.如权利...
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