本发明专利技术公开了一种成熟人β防御素-2及其制备方法，该方法是将谷氨酸残基引入人β防御素-2的成熟序列和前肽之间，通过重组表达得到人β防御素-2前原肽，经镍柱亲和层析纯化得到较高纯度的人β防御素-2前原肽，然后用带His-tag的重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶进行酶解处理，将前肽及亲和标签切除，并再次通过亲和层析去除重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶和其他杂质，纯度较高的成熟人β防御素-2存在于穿过液中。本发明专利技术所述的成熟HBD-2制备方法具有高效、安全无毒性、成本低和纯化工艺简单的优点，从而为成熟HBD-2的大规模制备及其应用奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域的基因重组表达
，具体涉及一种成熟人β防御素-2的新型制备方法。
技术介绍
人β防御素(HBD)是一种富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌甚至病毒都有较强的杀灭作用，因此在食品、化妆品和防腐等领域有着广泛的应用。人β防御素-2 (HBD-2)于1997年在银屑病皮损组织中发现(J.Harder，J.Bartels,E.Christophers,J.Schroder,A peptide antibiotic from human skin.Nature, 1997，(387):861-861 )，是HBD家族成员之一，其阳离子区可以与细菌细胞膜的阴离子磷脂头部基因及水分子相互作用，形成静电力，在膜上形成电压依赖性孔道，然后插入膜中形成多聚体形成更大的孔道，从而破坏靶细胞DNA，最终导致细胞溶解(D.M.Hoover, K.R.Rajashankarj R.Blumenthalj A.Puri, J.J.0ppenheimj 0.Chertovj J.Lubkowskij The structure of human β -defensin-2shows evidence of higher orderoligomerization.Journal of Biological Chemistry, 2000, (275):32911-32918)。有研究报道人防御素对肿瘤细胞的毒性比对非肿瘤细胞的毒性要强2-50倍，而且人防御素还能显著地提高阿霉素对耐多药肿瘤细胞的裂解作用(S.Johnstone, K.Gelmonj L.Mayer, R.HankcockjM.Bally, Peptide-mediated cytotoxicity and peptide-enhancedcytoxic activity of doxorubicin against wild—type and p-glycoproteinover-expressing tumor cell lines, Ant1-Cancer Drug Design，2000，(15):151-160)，且人β防御素-2在低浓度下能趋化树突状细胞(DC)和记性性T细胞朝着受致病微生物侵袭的病灶部位迀移，能提高人体的免疫机能(Yang D，Chertov 0，Bykovskaia S N，etal.Beta-defensiss: linking innate and adaptive immunity through dendritic and Tcell CCR6[J].Science，1999，(287):525-552，因此 HBD-2 还有应用于肿瘤治疗的前景。基于HBD-2的广泛应 用前景，HBD-2在大肠杆菌细胞(X.Fang，L.Peng，Z.Xu，J.Wuj P.Cenj Cloning and expression of human beta-defensin_2gene in Eseherichiacol1.Protein andpeptide letters, 2002，9 (I): 31-37 )和大肠杆菌无细胞表达体系Φ (H.Chen, Z.Xuj N.Xuj P.Cenj Efficient production ofa soluble fusion proteincontaining human beta—defensin_2in E.coli cell-free system.Journal ofbiotechnology，2005，(115): 307-315)均得到了表达，Fang 等(X.Fang，L Peng，Ζ.Xu，J.Wuj P.Cenj Cloning and expression of human beta-defensin_2gene in Eseherichiacol1.Protein andpeptide letters, 2002，9(1):31-37)在成熟 HBD-2 序列前融合其他分子量较大的蛋白(如硫氧还蛋白)，并在两者之间引入肠激酶识别位点，所得蛋白用肠激酶进行处理从而得到成熟HBD-2，以阳离子交换层析对成熟HBD-2进行纯化；Wang 等(F.Wang，X.Fang，Zhinan Xuj L.Peng,P.Cenj Fusion Expression of HumanBeta-Defensin-2from Multiple Joined Genes in Escherichia coli,PreparativeBiochemistry and Biotechnology, 2003 (34): 215-225)在大肠杆菌中以串联形式表达HBD-2前原肽多聚体，并在成熟序列前引入甲硫氨酸，用溴化氰裂解法除去其前肽，得到成熟的HBD-2。尽管在无细胞表达体系中HBD-2的产量及纯度都较高，但其制备成本太高，不适合大规模制备；用肠激酶处理去除HBD-2的前肽，处理时间相对较长，一般需要8-16h，切割效率相对低下，而且肠激酶还存在一定程度的非特异性切割(S.H.Shahravan, X.Qu, 1.S.Chan, J.A.Shin, Enhancing the specificity of the enterokinase cleavagereaction to promote efficient cleavage of a fusion tag.Protein Expression andPurification59, 2008, 314-319);且通过离子交换层析除去HBD-2前肽和肠激酶，无法保证成熟HBD-2的纯度；使用溴化氰裂解法除去HBD-2前肽，有较强的毒性，对实验人员健康不利，且不利于后期的应用，还存在一定的非特异性切割。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能简单高效地获得的较高纯度的成熟HBD-2，同时提供制备上述成熟HBD-2的方法，并使其能大规模应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现:一种成熟人β防御素-2的制备方法，包括如下步骤:( I)人β防御素-2前原肽重组表达载体的制备:a.以SEQ ID NO: 1-2的核苷酸序列为上、下游引物，以HBD-2前原肽序列为模板，进行PCR扩增，获得重组HBD-2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6标签，在其C端引入终止子；所述模板是将谷氨酸残基引入HBD-2全长序列(该全长序列为密码优化过的序列，GenBank ID:AY155 577)，通过全合成获得重组HBD-2前原肽序列，其核苷酸序列为SEQID NO:3 ；b.步骤a所得产物用NdeI和XhoI进行双酶切，然后与NdeI和XhoI双酶切的表达载体pET22b(+)连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞；C.从步骤b中感受态细胞中提取质粒进行双酶切及测序鉴定，所得阳性克隆转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞中进行表达，得到HBD-2重组表达载体；(2)重组HBD-2前原肽的制备a.工程菌诱导表达将步骤(I)所得HBD-2重组表达载体接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37°C振摇过夜本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种成熟人β防御素?2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）人β防御素?2前原肽重组表达载体的制备a．以SEQ?ID?NO:1?2的核苷酸序列为上、下游引物，以HBD?2前原肽序列为模板，进行PCR扩增，获得重组HBD?2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6标签，在其C端引入终止子；所述模板的核苷酸序列为SEQ?ID?NO:3；b．步骤a所得产物用NdeI和XhoI进行双酶切，然后与NdeI和XhoI双酶切的表达载体pET22b连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；c．从步骤b中感受态细胞中提取质粒进行双酶切及测序鉴定，所得阳性克隆转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行表达，得到HBD?2重组表达载体；（2）重组HBD?2前原肽的制备a．工程菌诱导表达将步骤（1）所得HBD?2重组表达载体接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37℃振摇过夜，然后按1：50的体积比接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，于OD=0.4?0.8时加入IPTG至终浓度为0.8mM，继续培养4h后收集菌液，离心，去除上清液，细菌沉淀用TE缓冲液洗涤2次后，用细菌裂解液重悬，于冰浴下超声，取超声后的匀浆物离心，收集上清液；b．表达产物的纯化取步骤a收集的上清液，以Ni2+?NTA树脂亲和层析法进行纯化，即得到重组HBD?2前原肽；（3）成熟HBD?2的制备a．重组HBD?2前原肽的酶处理取步骤（2）所得重组HBD?2前原肽，在20mM、pH8.5的Tris?HCl中透析12h，加入1%w/w的重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶，于37℃处理1h后立即置于0℃冰浴中以终止反应；b．成熟HBD?2的获得将步骤a酶处理过的HBD?2前原肽酶解液上样至Ni2+?NTA树脂亲和层析柱，收集穿过液，成熟的HBD?2即存在于所得穿过液中。...
【技术特征摘要】
1.一种成熟人β防御素-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)人β防御素-2前原肽重组表达载体的制备 a.以SEQID NO: 1-2的核苷酸序列为上、下游引物，以HBD-2前原肽序列为模板，进行PCR扩增，获得重组HBD-2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6标签，在其C端引入终止子；所述模板的核苷酸序列为SEQ ID NO:3 ； b.步骤a所得产物用NdeI和XhoI进行双酶切，然后与NdeI和XhoI双酶切的表达载体pET22b连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞； c.从步骤b中感受态细胞中提取质粒进行双酶切及测序鉴定，所得阳性克隆转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞中进行表达，得到HBD-2重组表达载体； (2)重组HBD-2前原肽的制备 a.工程菌诱导表达 将步骤(I)所得HBD-2重组表达载体接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37°C振摇过夜，然后按1:50的体积比接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，于OD=0.4-0.8...
【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，叶伟，王海鹰，马毅，于平儒，王小宁，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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