一种成熟人β防御素-2及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种成熟人β防御素-2及其制备方法，该方法是将谷氨酸残基引入人β防御素-2的成熟序列和前肽之间，通过重组表达得到人β防御素-2前原肽，经镍柱亲和层析纯化得到较高纯度的人β防御素-2前原肽，然后用带His-tag的重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶进行酶解处理，将前肽及亲和标签切除，并再次通过亲和层析去除重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶和其他杂质，纯度较高的成熟人β防御素-2存在于穿过液中。本发明专利技术所述的成熟HBD-2制备方法具有高效、安全无毒性、成本低和纯化工艺简单的优点，从而为成熟HBD-2的大规模制备及其应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域的基因重组表达
，具体涉及一种成熟人β防御素-2的新型制备方法。
技术介绍
人β防御素(HBD)是一种富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌甚至病毒都有较强的杀灭作用，因此在食品、化妆品和防腐等领域有着广泛的应用。人β防御素-2 (HBD-2)于1997年在银屑病皮损组织中发现(J.Harder，J.Bartels,E.Christophers,J.Schroder,A peptide antibiotic from human skin.Nature, 1997，(387):861-861 )，是HBD家族成员之一，其阳离子区可以与细菌细胞膜的阴离子磷脂头部基因及水分子相互作用，形成静电力，在膜上形成电压依赖性孔道，然后插入膜中形成多聚体形成更大的孔道，从而破坏靶细胞DNA，最终导致细胞溶解(D.M.Hoover, K.R.Rajashankarj R.Blumenthalj A.Puri, J.J.0ppenheimj 0.Chertovj J.Lubkowskij The structure of human β -de本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成熟人β防御素?2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）人β防御素?2前原肽重组表达载体的制备a．以SEQ?ID?NO:1?2的核苷酸序列为上、下游引物，以HBD?2前原肽序列为模板，进行PCR扩增，获得重组HBD?2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6标签，在其C端引入终止子；所述模板的核苷酸序列为SEQ?ID?NO:3；b．步骤a所得产物用NdeI和XhoI进行双酶切，然后与NdeI和XhoI双酶切的表达载体pET22b连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；c．从步骤b中感受态细胞中提取质粒进行双酶切及测序鉴定，所得阳性克隆转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行表达，...

【技术特征摘要】
1.一种成熟人β防御素-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)人β防御素-2前原肽重组表达载体的制备 a.以SEQID NO: 1-2的核苷酸序列为上、下游引物，以HBD-2前原肽序列为模板，进行PCR扩增，获得重组HBD-2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6标签，在其C端引入终止子；所述模板的核苷酸序列为SEQ ID NO:3 ； b.步骤a所得产物用NdeI和XhoI进行双酶切，然后与NdeI和XhoI双酶切的表达载体pET22b连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞； c.从步骤b中感受态细胞中提取质粒进行双酶切及测序鉴定，所得阳性克隆转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞中进行表达，得到HBD-2重组表达载体； (2)重组HBD-2前原肽的制备 a.工程菌诱导表达 将步骤(I)所得HBD-2重组表达载体接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37°C振摇过夜，然后按1:50的体积比接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，于OD=0.4-0.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，叶伟，王海鹰，马毅，于平儒，王小宁，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：