本发明专利技术公开了一种优化的AvBD2基因及其应用，所述AvBD2基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述AvBD2基因可转化至遗传工程菌种并进行蛋白表达，获得的重组表达蛋白与干酪乳杆菌混合，制成一种新型复合微生态制剂。该复合微生态制剂对畜禽的生产性能、免疫性能、肠道pH、肠道微生物等方面都有改善，有利于促进畜禽的生长，提高免疫力，增加饲料的消化率；在体外抑菌试验中，该复合微生态制剂对肠道致病菌具有较好的抑菌活性；动物实验中，在不添加任何抗生素药物的情况下，显著提高了畜禽的平均日增重和免疫性能，改善了畜禽肠道的菌群环境，促进畜禽的生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是基因工程
，尤其涉及的是一种优化的β‐防御素AvBD2基因及其应用。
技术介绍
自20世纪50年代起，抗生素的亚治疗剂量就被添加到饲料中来促进动物的生长。大量抗生素在养殖业中的滥用，已经导致耐药性细菌不断出现，一些感染性病原体甚至严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。随着人们关注度的不断提高和抗药性病原的传播，欧洲已经开始禁止在动物饲料中使用抗生素来促进动物生长。因此，寻找一种天然的无污染的能够替代抗生素的新型饲料添加剂迫在眉睫，它既拥有抗菌功能，又能促进动物生长，以降低饲养成本。防御素属于抗菌肽家族的一个亚族，是广泛分布于动植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子小肽。防御素具有广谱抗微生物活性，对细菌、真菌、螺旋体、病毒等均有抗性，且病源微生物不易产生耐药性，是宿主抵抗外来致病性微生物侵袭的重要防线，同时由于其在动物体的多种不同组织器官中持续性表达，也被认为是动物先天性免疫系统的一部分，具有重要的生理学功能。其主要特征是6个半胱氨酸残基形成的3对二硫键，成熟肽大约有38‐42个氨基酸，分子质量约为3‐4kDa。根据空间结构的不同，防御素可以分为3大类：α‐防御素、β‐防御素和θ‐防御素。禽防御素属于β‐防御素类，3对二硫键分别为Cys‐1～Cys‐5、Cys‐2～Cys‐4和Cys‐3～Cys‐6配对连接形成，富含精氨酸，具有亲水性和亲脂性、特征性β‐片层结构。迄今为止，已在禽体内发现了14种β‐防御素，这些禽防御素基因被分别命名为AvBD1～14。其中禽β‐防御素2(AvBD2)广泛分布于禽的各类器官组织中，尤其在粘液囊、食道、嗉囊、肝脏和胃等消化系统各器官组织中表达量较高。消化道为动物机体与食源性病原接触部位，也是其侵入部位。AvBD2具有良好的生物安全性，且具有较强的抗菌活性，能够抑制或者杀死病原菌，这对禽消化道健康，尤其对防止上消化道感染等机体局部防御和炎症中起着重要作用。在畜禽生产中可用于防治疾病，促进动物健康养殖,具有潜在的应用和开发价值，而分子重组技术是蛋白类或肽类产品开发应用的有效途径。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统既具有原核表达系统的表达量高、 可大规模培养的优点，又具有真核表达系统的蛋白翻译后修饰、加工及折叠的优势，且外源基因的遗传稳定性较好，是目前广泛应用的真核表达系统之一。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。毕赤酵母自身分泌很少量的蛋白，易于异源蛋白的分离纯化，且其分泌的蛋白存在翻译后加工修饰，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，因此更适合真核生物基因的表达。又因其表达水平稳定、发酵工艺成熟等优点，而成为目前最受欢迎的异源蛋白基因表达系统之一。醇氧化酶AOX1启动子(pAOX1)是P.pastoris表达中应用较多的启动子，其甲醇诱导性很强。但发酵过程中需要用有毒挥发性的甲醇作为诱导剂，需要碳源的转换，因而操作不方便，且外源蛋白的生产周期较长。甘油醛‐3‐磷酸脱氢酶启动子(pGAP)是P.pastoris的组成型强启动子，已用来表达许多异源蛋白，并获得了与pAOX1相似的产量。此外，GAP启动子有许多优势：重组菌发酵过程简单，安全性高且不需要大量甲醇的储存与运输，更适合大规模发酵生产，具有连续培养的潜能，且降低了目的蛋白的生产成本。酵母单细胞蛋白作为饲料具有明显的优势，如酵母干物质中蛋白质含量约50％‐60％；酵母菌中含有丰富的酶类，含有β‐葡聚糖(57.0％)、甘露聚糖(6.6％)、糖蛋白(22.0％)和几丁质等活性成分；蛋白质中含有动物机体所必须的各种氨基酸，特别是植物饲料中缺乏的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量较多，生物学价值大大优于植物蛋白质，单细胞蛋白的消化率高达85％～90％；既对动物具有促生长作用，又可提高机体免疫，对动物而言，酵母饲料是一种理想的生物活性蛋白质饲料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种优化的β‐防御素AvBD2基因及其应用，以提供一种优化的AvBD2基因序列，用于代替抗生素制备新型无污染的禽用生物饲料添加剂。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种优化的β‐防御素AvBD2基因，所述AvBD2基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种上述AvBD2基因在作为畜禽生物饲料添加剂中的应用。本专利技术还提供了一种含有上述AvBD2基因的重组表达载体。优选地，所述重组表达载体为整合有AvBD2基因序列的且不含氨苄Amp抗性的pGHKα表达载体。本专利技术还提供了一种含有上述AvBD2基因的遗传工程菌，所述遗传工程菌含有上述重组表达载体，或者，所述遗传工程菌的基因组中整合有外源的上述AvBD2基因序列。优选地，所述遗传工程菌为含有上述AvBD2基因的毕赤酵母GS115菌株。本专利技术还提供了一种利用上述遗传工程菌制备获得的重组表达蛋白，其特征在于，所述重组表达蛋白的制备方法为：(1)将所述遗传工程菌进行发酵，获得发酵液；(2)取发酵液的上清，浓缩，获得所述重组表达蛋白。本专利技术还提供了一种含有上述重组表达蛋白的微生态制剂，所述微生态制剂为由干酪乳杆菌与所述重组表达蛋白按照体积比1：10混合，其中，所述干酪乳杆菌的浓度为6×109CFU/mL，所述重组表达蛋白的浓度为2.6mg/mL‐5.2mg/mL。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供了一种优化的β‐防御素AvBD2基因及其应用，利用该优化的β‐防御素AvBD2基因可用于代替抗生素制备新型无污染的禽用生物饲料添加剂，即复合微生态制剂。该复合微生态制剂可直接饲喂畜禽，对畜禽的生产性能、免疫性能、肠道pH、肠道微生物等方面都有改善，有利于促进畜禽的生长，提高免疫力，增加饲料的消化率。另外，利用AvBD2基因制备的复合微生态制剂在体外抑菌试验中，对肠道致病菌具有较好的抑菌活性，在体内的动物饲喂实验中，在不添加任何抗生素药物的情况下，显著提高了畜禽的平均日增重和免疫性能，改善了畜禽肠道的菌群环境，促进畜禽的生长。附图说明图1为干酪乳杆菌的的生长曲线；图2为重组菌株AvBD2体外抑菌检测；图3为不同日龄肉鸡盲肠内容物ERIC-PCR检测结果；图4为不同日龄肉鸡回肠内容物ERIC-PCR检测结果。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例11、材料1.1、YPD培养基：包括10g/L的酵母粉，20g/L的蛋白胨B和20g/L的D～无水葡萄糖，115℃下灭菌15分钟。1.2、MRS培养基：包括10.0g/L的蛋白胨，8.0g/L的牛肉粉，4.0g/L的酵母粉，20.0g/L的葡萄糖，2.0g/L的磷酸氢二钾，2.0g/L的柠檬酸氢二胺，5.0g/L的乙酸钠，0.2g/L的硫酸镁，0.04g/L的硫酸锰和1.0g/L的吐温～80，25℃下调节pH值至5.7±0.2，118℃下灭菌15分钟。1.3、LB培养基：包括10.0g/L的胰蛋白胨，5.0g/L的酵母浸粉和10.0g/L氯化钠，25℃下调节pH值至7.0±0.1，121℃下灭本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种优化的β‑防御素AvBD2基因，其特征在于，所述AvBD2基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种优化的β-防御素AvBD2基因，其特征在于，所述AvBD2基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。2.一种如权利要求1所述的AvBD2基因在作为畜禽生物饲料添加剂中的应用。3.一种含有如权利要求1所述的AvBD2基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为整合有AvBD2基因序列的且不含氨苄Amp抗性的pGHKα表达载体。5.一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌含有如权利要求4所述的重组表达载体，或者，所述遗传工程菌的基因组中整合有外源的如权利要求1所述的AvBD2基因序列。6.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁克宗，涂健，魏海婷，石水琴，张明，吕小龙，汪雪雁，薛秀恒，蒋雯，袁林，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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