本发明专利技术涉及抗菌肽，具体涉及一种菲律宾蛤仔防御素Defensin?B基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。所述防御素Defensin?B基因为序列表SEQ?ID?NO.1中碱基序列所示。基因重组蛋白为序列表SEQ?ID?NO.2中氨基酸序列所示。本发明专利技术的防御素Defensin?B为菲律宾蛤仔抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗菌肽，具体涉及一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。
技术介绍
抗菌肽是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子蛋白，氨基酸数目小于100， 常带正电荷，并具广谱抗菌性的一类小肽，是生物体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、 真菌均有抑杀作用，还可以抗原虫、病毒，杀伤动物体内的肿瘤细胞，却不破坏动物体内的正常细胞。抗菌肽抗菌时一般没有特殊受体，直接通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果，因而不会诱导抗药株的产生，它属于小分子多肽，在动物体内容易降解，并且无毒副作用及药物残留问题，是绿色环保型药物。根据抗菌肽序列、结构和三维构象以及抗菌特性的差异，通常将已发现的抗菌肽分为以下四类(1)不含半胱氨酸的线型α螺旋抗菌肽，如蜂毒肽、蛙皮肽、天蚕抗菌肽等；( 含有二硫键的β折叠结构，如防御素、昆虫防御肽等；(3)由一种或多种氨基酸为主构成的多肽，如富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)前体蛋白剪切而来的多肽，如淡水螯虾O^cifastacus leniusculus)的血蓝蛋白C-端酶解后可产生具有抗菌活性的多肽。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新抗生素的发现极其困难的情况下，抗菌肽为开发新型的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。因此，抗菌肽的研究近年来倍受重视，已经深入到分子结构、作用机制、基因的表达与调控等方面。长期以来，抗菌肽的研究主要集中在昆虫和高等动物上，少数的海洋动物抗菌肽的研究则主要集中于鲎、对虾和几种鱼类上，贝类抗菌肽方面的研究起步则相对较晚。在海洋贝类中，贻贝的抗菌肽研究较为透彻，到目前为止，共发现了十余种富含半胱氨酸的抗菌肽，这些多肽在生理条件下均带正电荷，而且具有典型的双亲性结构。根据其一级结构和二硫键形成的不同形式，贻贝抗菌肽又可分为四种类型贻贝防御素(MGD)、贻贝素 (mytilins)、贻贝肽(myticins)和贻贝霉素(mytimycins)。目前国内外关于菲律宾蛤仔抗菌肽及其抗菌活性的研究较少。赵建民等利用大肠杆菌原核表达系统，体外重组表达菲律宾蛤仔大防御素(VpBD)蛋白，具有广谱的抗革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因所述防御素Defensin B基因为序列表 SEQ ID NO. 1中碱基序列所示。一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因重组蛋白所述防御素Defensin B基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因重组蛋白的应用所述防御素Defensin B基因重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。所述防御素Defensin B基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌都。所述防御素 Defensin B基因重组表达产物可作为制备对恶臭假单胞菌或金黄色葡萄球菌的抑菌药物。本专利技术所具有的优点1.本专利技术从菲律宾蛤仔中克隆到防御素Defensin B的全长cDNA序列，实现其重组表达并测定其抗菌谱和最小抑菌浓度，为菲律宾蛤仔的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和保鲜防腐剂奠定基础。2.与现有技术相比，本专利技术的防御素Defensin B为菲律宾蛤仔抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。本专利技术通过PCR技术，扩增编码防御素Defensin B成熟肽的基因片断并将其克隆到pET21(a)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中实现了原核体外重组表达。本专利技术的菲律宾蛤仔防御素Defensin B cDNA序列克隆及其体外重组表达，包括下列步骤1)菲律宾蛤仔总RNA的提取及mRNA的纯化；2)菲律宾蛤仔cDNA文库构建；3)菲律宾蛤仔cDNA文库EST序列的大规模测定；4)菲律宾蛤仔EST序列的同源性分析及防御素基因片段的筛5)用基因特异性引物 DBF 5 ‘ AAGTGCTTCGGCAAATCCTCAG 3 ‘和 DBR 5' TTCAACACTAGGCCGTCTCC 3'进行3’和5’RACE克隆得到菲律宾蛤仔防御素Defensin BcDNA全长序列；6)菲律宾蛤仔防御素Defensin B的体外重组表达及其活性分析。实施例1菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因为SEQ ID No. 1中所示的碱基序列。序列表SEQ ID No. 1为:cataactgacgagtcaacaagttccaaaaaatgttcgcaaaagcatgctttgttttgttctttgtgtgtataatggttggaagtgcttcggcaaatcctcagaagagattaacttgtgagtttggaggtgtccaggcatgtgccgctcactgtatcctgttaggttacactggtggatggtgcgacggtcataactactgtcattgcaagacgagtgggaaaagggaggcggagacggcctagtgttgaaatatcaagcagtcctgtatcatagaaatct3.3.3.3. 3. cagaacaaaaagcattagaa(a)序列特征 长度333bp (编码区 31_243bp) 类型碱基序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型双链DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)(f)特异性名称cDNA菲律宾蛤仔中克隆到防御素Defensin B的cDNA序列，该序列全长33!3bp，5，非编码区长30bp，3’非编码区长90bp，有多聚腺苷酸尾巴。该基因包括21!3bp的开放阅读框，编码70个氨基酸，其中编码序列的1-21位氨基酸为信号肽序列，成熟肽为49个氨基酸实施例2菲律宾蛤仔防御素Defensin B的制备一、菲律宾蛤仔总RNA的提取及mRNA的纯化用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔的血淋巴中提取总RNA，提取方法依^witrogen公司的Trizol试剂说明书进行取菲律宾蛤仔血细胞50ml，2000g离心lOmin，弃上清，向沉淀细胞中加入20ml的 TRIZOL ,用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡IOs ；加入氯仿，剧烈震荡30s ； 40C 10，OOOg高速离心IOmin ；吸取上清液于一个新离心管中，加入预冷的等体积异丙醇 (约15ml)，置于-20°C静置1小时以上；4°C 10，OOOg高速离心IOmin ；小心弃去上清液；用 5ml 70%乙醇清洗沉淀；4°本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种菲律宾蛤仔防御素Ｄｅｆｅｎｓｉｎ Ｂ基因，其特征在于：所述防御素Ｄｅｆｅｎｓｉｎ Ｂ基因为序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１中碱基序列所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴惠丰，张林宝，赵建民，王清，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：37
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