一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用技术

本发明专利技术涉及动物医药工程技术领域，提供了一种真核表达载体，由含有牛β-防御素4成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，牛β-防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；还提供了一种重组菌株；还提供了一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，包括1)牛β-防御素4成熟肽基因的制备；2)上述真核表达载体的构建；3)上述重组菌株的制备；4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。本发明专利技术所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽具有抗菌活性，且有一定的抗结核活性，适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用，而且生产成本低、生产效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用
本专利技术属于动物医药工程
，具体涉及一种牛β -防御素4成熟肽的制备方法，还涉及一种表达牛防御素4成熟肽的重组菌，同时还涉及一种牛β-防御素4成熟肽在畜牧生产和药物治疗中抗菌作用的应用。
技术介绍
防御素(defensin)属于内源性抗菌妝(endogenousantibioticpeptidees)家族，具备广谱抗微生物和细胞毒活性，对机体免疫至关重要。1991年，人们在牛气管黏膜上皮细胞中首次发现防御素-2这一阳离子多肽抗生素，命名为TAP(TracheaAntiniobial Peptide),而后在牛的粒细胞中又发现了 13种不同于α -防御素，却与TAP序列高度同源的防御素，故命名为β_防御素。由于β_防御素的结构特点为基因序列中含有两个exon，其中第二个exon编码成熟的β -防御素，即发挥活性的部分，而且成熟β -防御素中含有6个半胱氨酸，可形成3对二硫键，是β -防御素能够发挥生物活性的必要结构。但是动物体内天然防御素的含量较低，直接提取远不能满足需要，化学合成方法可行但成本太高，因此，通过基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真核表达载体，其特征在于，由含有牛β‑防御素4成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K‑mBNBD4，所述牛β‑防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种真核表达载体，其特征在于，由含有牛β -防御素4成熟肽基因与真核表达载体PPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，所述牛β -防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。2.—种重组菌株，其特征在于，由权利要求1所述的真核表达载体pPIC9K-mBNBD4转化毕赤酵母GSl 15构建制成的重组菌株。3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为 CGMCC N0.8938。4.一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)牛β-防御素4成熟肽基因的制备:根据GenBank上公布的BNBD4的⑶S区域核苷酸序列人工合成mBNBD4基因，并设计PCR引物， mBNBD4的上游引物:5' -GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3'； mBNBD4的下游引物:5' ~GCCGCGGCCG CCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT~3/。 2)权利要求1所述的真核表达载体的构建:双酶切mBNBD4基因和真核表达载体PPIC9K，胶回收mBNBD4基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16°C连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOPlO感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD4的构建； 3)权利要求3所述重组菌株的制备:将重组质粒pPIC9K-mBNBD4转化到感受态GSl15中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD4的毕赤酵母阳性转化子菌株； 4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：周向梅，赵德明，康静静，吕悦，杨利峰，尹晓敏，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11