本发明专利技术涉及动物医药工程技术领域，提供了一种真核表达载体，由含有牛β-防御素4成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，牛β-防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；还提供了一种重组菌株；还提供了一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，包括1)牛β-防御素4成熟肽基因的制备；2)上述真核表达载体的构建；3)上述重组菌株的制备；4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。本发明专利技术所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽具有抗菌活性，且有一定的抗结核活性，适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用，而且生产成本低、生产效率高。
【技术实现步骤摘要】
一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用
本专利技术属于动物医药工程
，具体涉及一种牛β -防御素4成熟肽的制备方法，还涉及一种表达牛防御素4成熟肽的重组菌，同时还涉及一种牛β-防御素4成熟肽在畜牧生产和药物治疗中抗菌作用的应用。
技术介绍
防御素(defensin)属于内源性抗菌妝(endogenousantibioticpeptidees)家族，具备广谱抗微生物和细胞毒活性，对机体免疫至关重要。1991年，人们在牛气管黏膜上皮细胞中首次发现防御素-2这一阳离子多肽抗生素，命名为TAP(TracheaAntiniobial Peptide),而后在牛的粒细胞中又发现了 13种不同于α -防御素，却与TAP序列高度同源的防御素，故命名为β_防御素。由于β_防御素的结构特点为基因序列中含有两个exon，其中第二个exon编码成熟的β -防御素，即发挥活性的部分，而且成熟β -防御素中含有6个半胱氨酸，可形成3对二硫键，是β -防御素能够发挥生物活性的必要结构。但是动物体内天然防御素的含量较低，直接提取远不能满足需要，化学合成方法可行但成本太高，因此，通过基因重组技术生产防御素多肽，以满足研究和生产的需要成为一种可倉泛。另外，有研究已证实牛巨噬细胞有牛嗜中性粒细胞β -防御素(BNBD) 4的表达，且分支杆菌主要感染巨噬细胞，并在巨噬细胞内生存，因此，我们推测BNBD4可能在对抗分支杆菌感染中发挥着重要的作用，并可作为一种分支杆菌的新型治疗药物而广泛使用，因此基于防御素的这一重要特点，我们进行了一种真核表达牛嗜中性粒细胞β -防御素4成熟肽的生产方法的研究。
技术实现思路
针对现有技术不足，本专利技术的目的是提供一种牛β -防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用。为实现上述目的，本专利技术提供一种真核表达载体，由含有牛β -防御素4成熟肽基因与真核表达载体PPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，所述牛β -防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。一种编码牛β -防御素4成熟肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本专利技术提供了一种重组菌株，由上述真核表达载体pPIC9K_mBNBD4转化毕赤酵母GSl 15构建制成的重组菌株。优选的，所述菌株为毕赤酵母阳性转化子菌株巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris (pPIC9K_mBNBD4),该菌株已于2014年3月20日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC N0.8938。本专利技术提供了一种牛β -防御素4成熟肽的制备方法，包括以下步骤:I)牛β -防御素4成熟肽基因的制备:根据GenBank上公布的BNBD4的⑶S区域核苷酸序列人工合成mBNBD4基因，并设计PCR引物，mBNBD4的上游引物:5' ~GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC~3/ ；mBNBD4的下游引物:5' ~GCCGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT~3/ 。2)上述真核表达载体的构建:双酶切mBNBD4基因和真核表达载体pPIC9K，胶回收mBNBD4基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16°C连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌T0P10感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD4的构建；3)上述重组菌株的制备:将重组质粒pPIC9K-mBNBD4转化到感受态GSl 15中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD4的毕赤酵母阳性转化子菌株；4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。优选的，步骤 3)中所述筛选依次为His+多拷贝转化子的筛选和Mut+转化子的筛选。优选的，所述步骤4)包括以下步骤:a、挑取PCR鉴定后证实已插入目的片段的His+、Mut+酵母转化子接种至YPD液体培养基中，28°C培养16-18h，离心弃上清；b、重悬菌体接种至诱导表达前培养基BMGY中，28°C培养18_24h，至0D600nm达到2-6时离心弃上清；C、重悬菌体接种至诱导表达培养基BMMY中，28°C连续培养72h，培养72h后收集表达培养液，离心取上清，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析，结果显示，与空载体对照相比，含有目的片段的酵母表达上清在7kD处有一特异性条带，说明有目的蛋白表达。优选的，诱导表达前培养基BMGY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K2HP043g/L、KH2PO4 11.8g/L、超纯水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02% 生物素的 500XBlmL/L、10% 甘油 100mL/L。优选的，诱导表达培养基BMMY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K2HPO43g/L、KH2PO4 11.8g/L、超纯水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02% 生物素的 500XBlmL/L、5% 甲醇 100mL/L。优选的，所述步骤c中，培养过程中每隔24h补充甲醇使其终浓度为1%。本专利技术提供了一种牛β -防御素4成熟肽在抗微生物感染中的应用。本专利技术的有益效果:对重组牛嗜中性粒细胞β -防御素4成熟肽(mBNBD4)进行体外生产表达研究，仅对牛嗜中性粒细胞β -防御素4具有生物学活性的成熟肽进行表达，同时为了方便纯化，添加了不影响蛋白生物学活性的6-His.tag，从而有利于重组蛋白的纯化，提高重组蛋白产量。毕赤酵母表达系统属于真核表达系统，表达出来的蛋白更接近于天然蛋白，有利于保持重组蛋白的天然结构，对于牛嗜中性粒细胞β_防御素4成熟肽(mBNBD4)有助于3对二硫键的形成，从而保持重组蛋白的活性。活性检测结果发现所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)具有抗菌活性，且有一定的抗结核活性，适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用，而且生产成本低、生产效率高。【附图说明】图1牛β -防御素4成熟肽的PCR结果；图2mBNBD4基因的测序比对结果；图3重组质粒pPIC9K_mBNBD4构建模式图；图4重组菌株基因组PCR鉴定-通用引物鉴定结果，其中，1-2为空质粒对照PPIC9K,3-8 为 pPIC9K-mBNBD4 ；图5重组菌株基因组PCR鉴定-mBNBD4特异性引物鉴定结果，其中，1_2为空质粒对照 PPIC9K，3-8 为 pPIC9K-mBNBD4 ；图6重组蛋白mBNBD4的鉴定结果:Tricine-SDS_PAGE鉴定结果，其中，1:诱导48h ；2:诱导60h ；3:诱导72h ；4:诱导84h ;箭头所指为最优表达时间(72h)；图7重组蛋白mBNBD4的鉴定结果:Western Blotting鉴定结果，I为空质粒对照PPIC9K表达产物，2为重组蛋白mBNBD4 ；图8重组蛋白mBNBD4对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制效果；图9重组蛋白mBNBD4对耻垢分支杆菌的抑制效果； 图10重组蛋白mBNBD4对牛分枝杆菌的抑制效果。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种真核表达载体，其特征在于，由含有牛β‑防御素4成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K‑mBNBD4，所述牛β‑防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种真核表达载体，其特征在于，由含有牛β -防御素4成熟肽基因与真核表达载体PPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，所述牛β -防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。2.—种重组菌株，其特征在于，由权利要求1所述的真核表达载体pPIC9K-mBNBD4转化毕赤酵母GSl 15构建制成的重组菌株。3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为 CGMCC N0.8938。4.一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)牛β-防御素4成熟肽基因的制备:根据GenBank上公布的BNBD4的⑶S区域核苷酸序列人工合成mBNBD4基因，并设计PCR引物， mBNBD4的上游引物:5' -GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3'； mBNBD4的下游引物:5' ~GCCGCGGCCG CCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT~3/。 2)权利要求1所述的真核表达载体的构建:双酶切mBNBD4基因和真核表达载体PPIC9K，胶回收mBNBD4基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16°C连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOPlO感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD4的构建； 3)权利要求3所述重组菌株的制备:将重组质粒pPIC9K-mBNBD4转化到感受态GSl15中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD4的毕赤酵母阳性转化子菌株； 4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：周向梅，赵德明，康静静，吕悦，杨利峰，尹晓敏，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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