抗组织因子单克隆抗体制造技术

本发明专利技术提供一种对组织因子的新型抗体。另外，本发明专利技术提供一种利用该抗体作为靶标结合因子的医药组合物。本发明专利技术的抗体能够发挥向表达组织因子的细胞的内化能力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗组织因子单克隆抗体和利用该抗体的医药组合物。
技术介绍
本说明书包括作为本申请优先权的基础的日本专利申请2014-18586号的说明书和/或附图所记载的内容。将本说明书所引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考并入至本说明书中。通常，若通过口服或静脉内注射将药物进行全身给药，则不仅是对作为投药对象物的病灶部位，而且对正常组织也供给药物。其结果，确认到因药物给药所造成的副作用，有时需要变更或中断治疗方法。对此，以降低副作用为目的，已开发有对给药对象物固有的受体、配体、酶等分子标记具有特异性结合能力的所谓分子靶向药物的药物(例如专利文献1)。另一方面，组织因子(以下有时称为“TF”)为外源性凝血的起始因子，因血管损伤等而促进产生。通常反应中的TF表现为局部性且暂时性的。然而，已知在胰腺癌、胃癌等许多实体癌中，在肿瘤组织内的癌细胞、血管内皮细胞和单核细胞、巨噬细胞等的细胞表面，TF持续性地表达增强。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利公开公报2012/0039989
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的一个目的在于提供对TF的新型抗体。另外，本专利技术的另一个目的在于提供利用该抗体作为靶标结合因子的医药组合物。用于解决课题的方法本专利技术的专利技术者等人发现具有向细胞的内化能力的新型的抗TF单克隆抗体，进而想到通过使用该抗体作为靶标结合因子，能够将药物高选择性地送达于表面表达TF的细胞，从而完成了本专利技术。即，根据本专利技术，提供与组织因子结合的以下的单克隆抗体。一种抗人类组织因子单克隆抗体，其含有：具有分别含序列编号3、4和5所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号6、7和8所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2、3的轻链可变区；一种抗人类组织因子单克隆抗体，其含有：具有分别含序列编号11、12和13所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号14、15和16所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2、3的轻链可变区；或一种抗小鼠组织因子单克隆抗体，其含有：具有分别含序列编号19、20和21所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号22、23和24所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2、3的轻链可变区。根据本专利技术的另一方面，提供一种单克隆抗体，其结合至与上述单克隆抗体所结合的组织因子的表位相同的表位。根据本专利技术的再一方面，提供一种抗体的片段，其含有上述单克隆抗体的一部分，能够与组织因子结合。根据本专利技术的再一方面，提供一种医药组合物，其含有作为靶标结合因子的上述单克隆抗体或抗体的片段、与药物。根据本专利技术的再一方面，提供一种药物传递用组合物，其含有作为靶标结合因子的上述单克隆抗体或抗体的片段。专利技术的效果本专利技术的单克隆抗体能够识别表达TF的细胞，且具有向该细胞的内化能力。因此，通过利用该抗体作为靶标结合因子，能够有效地将药物传递至该细胞。附图说明图1是表示内化测定的结果的显微镜照片。图2是表示抗凝血作用评价的结果的图表。图3是表示杀细胞效果确认试验的结果的图表。图4是表示抗肿瘤效果确认试验中的肿瘤体积变动的图表。图5是表示抗肿瘤效果确认试验中的体重变动的图表。图6是表示内化测定的结果的显微镜照片。图7是表示小鼠B16黑色素瘤细胞及其TF强制表达细胞中，TF的mRNA表达量相对于GAPDH的mRNA表达量的比例的图表。图8是通过FACS解析所得的直方图(histogram)。具体实施方式[A.单克隆抗体]根据本专利技术，提供一种与TF结合的单克隆抗体。本专利技术的单克隆抗体代表性地能够与TF结合，且具有向表达TF的细胞的内化能力。TF是血液凝固的第III因子，作为跨膜型的糖蛋白而表达于细胞表面。本专利技术中，TF优选为人类TF(hTF)。hTF的全长氨基酸序列已知为GenBankACCESSION_AAA61152(序列编号1)。本专利技术中，也提供对小鼠TF(mTF)的单克隆抗体。利用抗mTF单克隆抗体作为药物的靶标结合因子，可有效用于使用小鼠的试验或研究。mTF的全长氨基酸序列，已知为GenBankACCESSION_AAA63400(序列编号2)。本说明书中，所谓内化，是指抗体与细胞表面的抗原形成免疫复合体后，被摄入至细胞内的现象。抗TF单克隆抗体是否具有内化能力，能够通过例如下述方法判断：使结合了标记物质的抗体与表面表达TF的细胞接触，确认该标记物质是否转移至细胞内的方法；在使结合了具有细胞毒性的物质的抗体与表面表达TF的细胞接触时，确认是否有细胞死亡或诱导细胞增殖抑制的方法等。更具体而言，能够通过实施例中记载的内化测定，确认有无抗体的内化能力。作为上述在表面表达TF的细胞，可使用任意适当的细胞，可列举例如肿瘤组织内的细胞。相对于正常组织中的TF的表达通常为局部性且暂时性的表达，肿瘤组织内的癌细胞、血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等的细胞表面中，TF的表达持续性地增强。作为癌细胞的具体例，可列举例如胰腺癌细胞、胃癌细胞等。本说明书中，所谓单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞所产生的抗体。单克隆抗体具有均匀的一级结构，识别同一表位。本专利技术的单克隆抗体具有由使相同的2条重链与相同的2条轻链通过二硫键结合而成的四聚体所构成的基本结构。本专利技术的抗TF单克隆抗体可为IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的任意同种型，优选为IgG。本专利技术的抗TF单克隆抗体所识别的表位，优选存在于TF的细胞外区域。本专利技术的抗TF单克隆抗体对于TF的解离常数(KD)，达到例如5×10-9M以下、进而1×10-9M以下、尤其2×10-10M以下。解离常数例如可使用表面等离子体共振法进行测定。本专利技术的抗TF单克隆抗体可具有或不具有抗凝血作用。抗凝血作用的有无或其程度，能够通过凝血酶原时间(PT)判断。若为不具有抗凝血作用或抗凝血作用低的抗TF单克隆抗体，则难以被血凝块等所捕捉，故在作为药物的靶标结合因子利用时可提升药物对靶标部位的送达性，其结果能够适当地发挥药效。本专利技术的抗TF单克隆抗体在形成为抗原抗体复合体的状态下的凝血延长时间比(PBS相对比)，优选为3以下、更优选为2以下、进一步优选为1～1.5。形成为抗原抗体复合体的状态下的凝血延长时间比可通过实施例记载的方法确定。[A-1.抗hTF单克隆抗体]第一实施方式中，本专利技术的抗hTF单克隆抗体含有：具有分别含序列编号3、4和5所述的氨基酸序列的互补性决定区(CDR)1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号6、7和8所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的轻链可变区。作为其具体例，可优选例示具有含序列编号9所述的氨基酸序列的重链可变区、和含序列编号10所述的氨基酸序列的轻链可变区的抗hTF单克隆抗体。第二实施方式中，本专利技术的抗hTF单克隆抗体含有：具有分别含序列编号11、12和13所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号14、15和16所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的轻链可变区。作为其具体例，可优选例示具有含序列编号17所述的氨基酸序列的重链可变区、和含序列编号18所述的氨基酸序列的轻链可变区的抗hTF单克隆抗体。上述第一或第二实施方式所例示的各单克隆抗体的改变体，也可包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆抗体，其与组织因子结合，该单克隆抗体的特征在于，其为：抗人类组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号3、4和5所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号6、7和8所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区；抗人类组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号11、12和13所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号14、15和16所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区；或抗小鼠组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号19、20和21所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号22、23和24所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.03 JP 2014-0185861.一种单克隆抗体，其与组织因子结合，该单克隆抗体的特征在于，其为：抗人类组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号3、4和5所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号6、7和8所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区；抗人类组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号11、12和13所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号14、15和16所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区；或抗小鼠组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号19、20和21所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号22、23和24所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区。2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其为：抗人类组织因子单克隆抗体，含有：含有序列编号9所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的重链可变区；和含有序列编号10所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的轻链可变区；抗人类组织因子单克隆抗体，含有：含有序列编号17所述的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：松村保广，安永正浩，古贺宣胜，山本祥之，佐藤隆太，津村辽，片冈一则，西山伸宏，三浦裕，真锅史乃，加藤泰己，
申请(专利权)人：国立研究开发法人国立癌症研究中心，国立大学法人东京大学，国立研究开发法人理化学研究所，那野伽利阿株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP