本发明专利技术公开一种灵芝酸高产工程菌株kmust‑Lae，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.12236，本发明专利技术提供的灵芝工程菌，是通过选用灵芝强启动子P‑gpd高表达甲基转移酶Lae基因，得到高产灵芝酸灵芝工程菌kmust‑Lae；通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其细胞生长不受影响的情况下，Lae转化子菌株产单体灵芝酸GA‑Me，GA‑T，GA‑Mk，GA‑S分别是WT菌株的2.6，2.2，2.7，2.1倍，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和代谢工程领域的，具体涉及一种通过基因工程在灵芝中表达甲基转移酶 loss of aflR expression ( Lae)基因的方法，构建了一个灵芝酸的高产工程菌株。
技术介绍
灵芝 (Ganodermalucidum ) 是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在我国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技术、药理学作用及临床应用等情况。灵芝酸是一类分子结构中含有羧基的三萜类物质，从结构来看它属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分离得到灵芝酸以来，目前已有130多种灵芝酸被分离出来。它们多为四环三萜类化合物，含有30个碳原子，结构中一般都有羟基，在IR中有较强的羟基吸收峰。在紫外光谱中也呈现多个波长的特征吸收，多数是在250 nm、237nm、365 nm处有吸收峰。灵芝酸具有许多重要的药理活性如：抗癌，灵芝酸类物质能明显抑制小鼠肝肉瘤 ( HTC ) 细胞的增殖；护肝，灵芝中的灵芝酸提取物能加强其解毒作用；抗HIV；降血压；抗氧化；抑制血小板凝集，抑制组胺释放，镇痛，抑制真核细胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白转移酶活性和促进体液免疫功能等作用。随着人们生活水平的提高，各种疾病的发生率也逐年递增。于是，人们对健康的关注也越来越来广泛。灵芝作为一种良好的中药对提高人体免疫力，抗氧化等方面具有重要的地位，尤其是在治疗癌症方面表现尤为突出。由于野生灵芝生长周期长，受环境因素影响大且野生灵芝资源有限，灵芝菌丝培养成为生产活性物质的重要方法。随着对灵芝活性物质需求的不断增加，如何提高灵芝的产量和增加灵芝的有效成分越来越引起人们的关注。液体深层发酵技术是进行快速工业化生产的重要手段。现在市售的灵芝酸主要是从灵芝子实体和液体深层发酵得到的菌丝体中获得。由于野生灵芝液体深层发酵时灵芝酸在灵芝细胞中的含量较低，分离纯化也较难，限制了灵芝酸的活性及作用机理研究及其广泛应用。近年来，基因工程与代谢工程迅速发展，成为了现代分子育种的重要手段。通过分子克隆和基因拼接等分子生物学方法来改造菌株的基因组，从而提高活性成分的含量越来越受学者们的青睐。如何从分子水平上提高灵芝酸的产量是目前急需解决的技术问题。灵芝酸合成途径首先是由乙酰辅酶A ( Acetyl CoA ) 在硫解酶 ( AcetoacetylCoA thiolase ) 催化下缩合形成乙酰乙酰辅酶A ( Acetoacetyl CoA )，乙酰乙酰辅酶A经HMG-CoA合成酶 ( HMG-CoA synthase ) 催化与另一分子乙酰CoA缩合生成3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶A ( HMG-CoA )，然后HMG-CoA还原酶( HMG-CoA reductase, HMGR )催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸。甲羟戊酸经甲羟戊酸激酶 ( MVK )、甲羟戊酸5-磷酸激酶( PMK )和MDD三步酶促反应转化为IPP。IPP进一步转化成法呢酯焦磷酸FPP。FPP 在鲨烯合酶squalene synthase ( SQS ) 的催化下合成鲨烯SQS后经过鲨烯单加氧酶的作用产生鲨烯2, 3-氧化物，再经过羊毛甾醇合酶 ( LS ) 的作用产生羊毛甾醇。羊毛甾醇又经过一系列氧化还原反应生成灵芝酸。Lae基因的表达产物是一种甲基转移酶，最早在曲霉属真菌中发现并鉴定。Lae与两种DNA结合蛋白（VeA和VelB）结合形成三体复合物，在不同的丝状真菌中，该复合物能够全局调控次级代谢、形态发育等。研究表明Lae甲基转移酶通过对宿主染色体进行修饰，可以激活次级代谢生物合成结构基因的表达，进而影响代谢产物的合成。例如，在曲霉菌属中缺失Lae基因降低了青霉素，洛伐他汀等的产量，而高表达Lae基因后青霉素，洛伐他汀等次级代谢产物产量有显著提高。Lae甲基转移酶与两种DNA结合蛋白（VeA和VelB）结合形成的三体复合物还与丝状真菌的形态发育相关，在构巢曲霉、烟曲霉中Lae基因缺失菌株其无性孢子的产生量低于正常菌株，在黄曲霉中，Lae基因缺失菌株的菌丝中很难生产菌核、过量表达Lae基因后菌丝内菌核的含量明显增加。在灵芝中，前期的研究表明灵芝酸生物合成基因（如HMGR, FPS, LS和SQS等）的表达量与灵芝酸的产量正相关； 灵芝无性孢子产生的数量也与灵芝酸的产量紧密相关。Lae基因的作用与功能在真菌中具有一定的保守性。我们在灵芝中克隆到了灵芝的Lae基因，灵芝的Lae基因可能会通过影响灵芝无性孢子的产生和次级代谢生物合成基因的表达，调控灵芝中次级代谢产物的积累。目前灵芝的Lae 基因对灵芝酸合成的影响尚不清楚。我们率先在灵芝细胞中高表达了灵芝的Lae基因，获得了Lae基因过量表达的灵芝工程菌株，工程菌株细胞的生长速率以及生产灵芝酸的水平有显著提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决野生型灵芝菌株自身产灵芝酸较低的问题，提供一种灵芝酸高产菌株，该菌株为高产灵芝酸的灵芝 (Ganoderma lucidum ) 工程菌kmust-Lae，已于2016年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.12236。本专利技术灵芝酸高产工程菌株的构建方法如下：以PMD19-T为起始载体并使用灵芝本身的强启动子P-gpd、终止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因 ( 具有carboxin抗性 ) 是来自灵芝本身的抗性基因，其特点是在蘑菇类担子菌的转化体系中同源标记基因的转化效率更高，能够稳定遗传，抗性强。1、将灵芝启动子P-gpd与终止子T-sdhB与PMD19-T连接，将灵芝cbx抗性基因插入到Pst I酶切位点，从而构建成pJW-EXP载体；其具有灵芝的强启动子和终止子，并具有灵芝本身的抗性；其中扩增灵芝强启动子P-gpd的引物序列为：P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3’，P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3’；扩增灵芝sdhB基因终止子的引物序列为：T-sdhB-F: 5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3’，T-sdhB-R : 5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3’；扩增灵芝cbx抗性基因的引物为：cbx-F：5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’，cbx-R：5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’；2、灵芝的Lae基因从灵芝基因组中克隆 ( 所用的引物为Lae-Nhe-F和Lae-Sma-R ) ，并插入到pJW-EXP载体中，得到pJW-EXP-Lae载体；引物序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种灵芝酸高产工程菌株kmust‑Lae，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.12236。
【技术特征摘要】
1.一种灵芝酸高产工程菌株kmust-Lae，其在中国微生物菌种保...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐军伟，姜露熙，张德怀，李焕军，岳同辉，李娜，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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