本发明专利技术提供了一种α‑葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株和α‑葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中的应用。本发明专利技术还提供了一种提高黑曲霉糖化酶酶活的方法和一种制备α‑葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株及其应用。
技术介绍
糖化酶是目前最重要的工业酶制剂之一，是淀粉糖化发酵生产酒精主要酶类，全名为葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)。糖化酶是一种外切型糖苷酶，能从淀粉的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，水解成一个个的葡萄糖单元，并像β-淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。对于支链淀粉，它可以缓慢水解a-1,6糖苷键生成葡萄糖单糖，但水解a-1,6糖苷键的能力(kcat/Km)只有水解a-1,4糖苷键的0.2％。糖化酶还能微弱水解a-1,3连接的碳链，但水解a-1,4糖苷键的速度最快，在工业上糖化酶用于将淀粉转化为葡萄糖，因此被广泛地应用于食品加工业、医疗保健、酿酒、氨基酸生产以及抗生素和有机酸等发酵工业。黑曲霉(Aspergillus niger)是市面上生产糖化酶的特殊菌株之一。黑曲霉的α-淀粉酶活性低，糖化酶活力强，多数黑曲霉的糖化酶能水解80％以上的淀粉，与其他菌株相比较利用黑曲霉生产糖化酶具备产量高，活性好，安全性高的特点。Tamayo-Ramo等研究者运用黑曲霉产糖化酶的表达体系来表达多铜氧化酶漆酶，Krasevec N等利用黑曲霉丝状真菌系统表达未正确折叠的分泌蛋白G-CSF，都验证了黑曲霉具有稳定的特异的高表达蛋白酶系统。本研究选用工业上高效表达糖化酶的黑曲霉HE01作为丝状真菌表达糖化酶的表达系统。糖化酶的产量活力及酶制剂的高纯度虽然在近年来取得了较大的进展。但遇到了α-葡萄糖苷转移酶在糖化酶中表现出较高活性的难题。而黑曲霉在生产糖化酶的同时也会伴随着α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的产生，α-葡萄糖苷酶的存在会影响糖化酶制剂的纯度。同样是支链淀粉，α-葡萄糖苷酶水解的主要是α-1,6糖苷键，生成的产物是低聚麦芽糖和糖肽等，α-葡萄糖苷酶会和糖化酶竞争底物，弱化糖化酶催化淀粉水解成葡萄糖的能力。基于传统的去除α-葡萄糖苷 酶的工艺法如沉淀法，离子交换树脂法等不但成效低，还影响糖化酶的活力。本专利技术就利用基因工程的生物技术方法敲除黑曲霉中的α-葡萄糖苷酶基因，使得α-葡萄糖苷酶不再抑制糖化酶水解淀粉的效率，从源头上解决α-葡萄糖苷酶对糖化酶的负影响，以期获得纯度更高的糖化酶。本专利技术涉及一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心保藏单位地址：中国武汉武汉大学保藏日期：2016年4月22日分类命名：Aspergillus niger HE01-Δα-glu保藏编号：CCTCCNO:M2016221
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏号为CCTCC NO:M2016221。本专利技术的另一个目的是提供α-葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中的应用。本专利技术的又一个目的是提供一种提高黑曲霉糖化酶酶活力的方法，所述方法包括敲除黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因的步骤。本专利技术的再一个目的是提供一种制备α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方法，包括以下步骤：(1)扩增或者合成黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因上游和下游各约1000bp的α-gluE1、α-gluE2片段，以及选择性标记抗性基因；其中所述抗性基因优选诺尔丝菌素抗性基因(NR)；(2)构建敲除表达盒α-gluE1-NR和NR-α-gluE2两个融合片段；(3)制备黑曲霉原生质体；(4)将线性化的敲除表达盒共转化黑曲霉原生质体；(5)培养和筛选转化后的黑曲霉原生质体获得α-葡萄糖苷酶基因敲除的阳性转化子。进一步培养上述步骤所获得的阳性转化子获得α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株。附图说明图1是3株转化子的Ver-1和Ver-2片段1％琼脂糖凝胶电泳条带；其中，M:250bp DNA ladder Marker；1,3,5泳道分别是:第1株、第2株、第3株转化子的Ver-1片段(1185bp)；2,4,6泳道分别是:第1株、第2株、第3株转化子的Ver-2片段(1231bp)。图2是突变株的SDS-PAGE分析图；其中，M：Takara High Protein Marker；1:出发株糖化酶条带；2:突变株糖化酶条带。图3是出发株和突变株在察式液体培养基中的生长曲线；其中，圆点表示出发株，正方形表示突变株。图4是出发株和突变株在可溶性淀粉液体培养基中的生长曲线；其中，正三角表示出发株，倒三角表示突变株。图5是出发株和突变株的糖化酶酶活。图6是出发株和突变株的α-葡萄糖苷酶酶活。图7是GA基因在出发株和突变株相对表达情况。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步对本专利技术进行说明，不能理解为是对本专利技术的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。菌株和质粒黑曲霉HE01购自湖北立业生物公司。克隆质粒pMD19-T Simple Vector购买于TaKaRa公司，是具有氨苄青霉素抗性(Amp.R)和TT碱基末端的线性质粒载体。培养基(1)察氏培养基：蔗糖3％，硝酸钠0.2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，硫酸亚铁0.001％，固体加琼脂1.7％，半液体加琼脂0.05％。盐离子无机物和有机物分开灭菌121℃，0.1MPa，30min。配制时用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调整PH值至5.5～6.0。(2)可溶性淀粉固体培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，酵母粉0.2％，可溶性淀粉3.0％，氯化钠0.2％，琼脂1.7％(液体为0.5％)。用1mol/L NaOH和HCl调PH至4.9～5.0，121℃，0.1MPa，30min灭菌分装后4℃保存。(3)Mandels培养基：用于黑曲霉HE01的液体培养。50×Mandels营养盐浓缩液20mL/L，1000×Mandels微量元素浓缩液1.0mL/L，蛋白胨1.0g/L，1M 柠檬酸缓冲液(pH 4.5)50mL/L，吐温80 1.0-2.0g/L，无水葡萄糖10g/L(单独配制，灭菌后混合)。用于黑曲霉转化子的复筛培养时，可加入125μg/mL诺尔丝菌素硫酸盐抗生素。(4)种子培养基：用于里黑曲霉HE01及其阳性转化子的非诱导产酶培养。玉米浆2％，糊精12％，DF103为0.075％，硫酸铵2％(单独配制，灭菌后混合)。培养条件：32℃，100rpm，培养7d～10d。(5)产酶发酵培养基：玉米淀粉26.8％，玉米浆5.36％，豆饼粉3.57％，DF103消泡剂0.357％，耐高温α-淀粉酶5％，硫酸铵1％和磷酸二氢钾0.9％(单独配制，灭菌后混合)。培养条件：32℃，100rpm，培养7d～10d。寡聚核苷酸引物表1实施例中使用到的引物注：倾斜字体为overlap PCR引物加入的反向互补碱基序列。【实施例1】黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因α-gluE1、α-gluE2以及选择性标记基因的扩增用OMEGA试剂盒提取黑曲霉HE01的基因组DNA，以之为模板，以GLU-1F、GLU-2R为α-葡萄糖苷酶基因(GenBank：D45356.1)上游的一对引物，以GLU-3F、GLU-4R为α-葡萄糖苷酶基因下游的一对引物，采用Tra本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种α‑葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏号为CCTCC NO：M2016221。
【技术特征摘要】
1.一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏号为CCTCC NO：M2016221。2.α-葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中的应用。3.一种提高黑曲霉糖化酶酶活的方法，其特征在于，所述方法包括敲除黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因的步骤。4.一种制备α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方法，包括以下步骤：(1)分别扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员：余少文，杨丽娟，胡萍，谢宁，汤新，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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