本发明专利技术涉及将两个或更多个拷贝的目标多核苷酸同时整合到真菌宿主细胞的染色体中的方法，该染色体包括至少两对位点特异性重组酶的识别序列，每对识别序列位于驻留阴性选择标记的两侧；对细胞转化携带侧翼也是识别序列的目标基因的构建体，以确保在重组酶短暂表达之后的双交换事件，接着选择所有阴性选择标记都被切除的细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及将两个或更多个拷贝的目标多核苷酸同时整合到真菌宿主细胞的染色体中的方法，该染色体包括至少两对位点特异性重组酶的识别序列，每对识别序列位于驻留阴性选择标记的两侧；对细胞转化携带侧翼也是识别序列的目标基因的构建体，以确保在重组酶短暂表达之后的双交换事件，接着选择所有阴性选择标记都被切除的细胞。【专利说明】丝状真菌中多个基因拷贝的同时位点特异性整合对序列表的引用本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式并入本文以作参考。
本专利技术涉及使用短暂表达的重组酶连同合适的驻留(resident)选择标记将多个拷贝的目标多核苷酸同时位点特异性地整合到真菌宿主细胞的基因组中的方法。
技术介绍
已经发现大量的自然产生的生物体产生有用的多肽产物，例如酶，酶的大规模生产为研究和商业用途所需。在鉴定出这样的多肽产物后，经常要致力于开发具有改进的生产率的制造方法。一种广泛运用的基于重组DNA技术的方法是克隆编码该产物的基因，并将该基因插入到合适的表达体系中，从而在有益于产物表达的条件下在合适的宿主细胞中表达该产物，该基因或是整合到染色体中，或是作为染色体外的实体。无论使用何种生产方法，通常期望提高给定的多肽或蛋白质的生产水平。因此，正在为增加生产而作出努力，例如，通过将编码该产物的基因插入到强表达信号的控制下，增加所转录的mRNA的稳定性或通过增加所考虑的生产生物体中该基因的拷贝数。后一种方法可以通过将该基因插入到多拷贝质粒中来实现，但是通常多拷贝质粒存在在所考虑的宿主细胞中不稳定的倾向，或者通过将多个拷贝的该基因整合到生产生物体的染色体中来实现，该途径由于构建体的稳定性趋向于是更高的而通常被认为是更具有吸引力的。宿主细胞的构建已被描述过，其中高度表达的染色体基因由位点特异性重组酶的识别序列替代，从而可以在 随后通过使用识别所述序列的重组酶将单个编码产物的多核苷酸插入到那个位点(EP1405908A1 ；ProBioGen AG)。已经公开了在基因组中的已知位置插入DNA (O’ Gorman等，1991Science,251:1351-55 ;Baubonis 和 Sauer, 1993Nucl.，Acids Res., 21:2025-29 ；Albert等，1995Plant J.，7:649-59)。这些方法利用自由可逆的位点特异性重组体系。这些可逆体系包括以下:来自卩遼菌体Pl的Cre-1ox体系(Baubonis和Sauer, 1993,见上文；Albert 等，1995Plant J.，7549-59),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 FLP-FRT体系(O，Gorrnan 等，1991,见上文)，Zygosaccharonzyces rouxii 的 R-RS 体系(Onouchi等，1995Mol.Gen.Genet.247:653-660),来自 Mu 噬菌体的改良 Gin-gix 体系(Maeser 和Kahmann, 1991Mol.Gen.Genet.，230:170-76),来自枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)质粒的 β -重组酶-six 体系(Diaz 等，1999J.Biol.Chem.274 =6634-6640)以及来自细菌转座子 TnlOOO 的 δ - Y-res 体系(Schwikardi 和 Dorge, 2000E B S let.471:147-150)。Cre、FLP、R、Gin、β -重组酶和 δ -y 是重组酶，lox、FRT、RS、gix、six 和 res是各个重组位点(由 Sadowslu, 1993FASEB J.,7:750-67 ；0w 和 Medberry, 1995Crit.Rev.Plant Sc1.14:239-261综述)。多重Cre/lox重组允许选择性位点特异性DNA靶向酵母基因组中的自然位点和工程化位点(Sauer, B.Nucleic Acids Research.1996, Vol.24(23):4608-4613)。已经显示使用链霉菌属(Sti^ptomyces)噬菌体OC31的衍生物感染具有自然附着位点attB和异位引入的attB位点的宿主细胞，结果使该噬菌体整合到两个attB位点中(Smith等，2004, Switching the polarity of a bacteriophage integrationsystem.Mol Microbiol51 (6): 1719-1728)。使用Mx9噬菌体转化体系，多个拷贝的基因可以引入到包含多个被Mx9整合酶识别的附着位点的细胞中(W02004/018635A2)。温带Iactococcal卩遼菌体TP901-1整合酶和识别序列是良好表征的(Breiiner等，(1990)Novel Organization of Genes Involved in Prophage Excision Identified in theTemperate Lactococcal Bacteriophage TP901-1.J Bacterioll81 (23):7291-7297 ；Breiiner等，2001.Resolvase-like recombination performed by the TP901-lintegrase.Microbiologyl47:2051-2063)。 以上的位点特异性重组体系具有共同的性质，即单一的多肽重组酶催化相同序列或近乎相同序列在两个位点间的重组。每个重组位点由短的不对称间隔序列组成，在该短的不对称间隔序列处发生链交换，该短的不对称间隔序列在两侧有重组酶结合的反向重复序列。间隔序列的不对称性对重组位点提供了一个方向，并规定了重组反应的结果。直接或间接定向的顺式位点之间的重组分别切除或倒置干预DNA。反式位点之间的重组引起两个线性DNA分子的相互易位，或者，如果两个分子之中有至少一个是环形的，则引起共整合。因为由重组产生的产物位点自身是随后重组的底物，所以反应是自由可逆的。但是，在实际中，因为两个重组位点紧密相连的地方的分子内相互作用的可能性远远高于不相连位点间的分子内相互作用的可能性，所以切除基本上是不可逆的。必然的结果是插入到基因组重组位点中的DNA分子会很容易地切除掉。已经公开了在真核生物的基因组中进行DNA取代、易位和叠加的方法，在这些方法中多个基因可以一步步整合(W002/08409)。通过位点特异性和短暂表达的整合酶在微生物宿主细胞中进行多个拷贝的无启动子开放阅读框或操纵子的同时基因组整合(W02006/042548)早前已经在芽孢杆菌(Bacillus)宿主中示出。
技术实现思路
本专利技术涉及将两个或更多个拷贝的目标多核苷酸整合到真菌宿主细胞的染色体中的方法，该方法通过以下步骤进行:Ca)提供在其染色体内包括至少两个整合位点的真菌宿主细胞，每个整合位点包括一对位点特异性重组酶的识别序列，每对识别序列位于驻留(resident)选择标记的两侧；(b)向所述细胞中引入核酸构建体，该核酸构建体包括一对位点特异性重组酶的识别序列，该识别序列对位于目标多核苷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于将两个或更多个拷贝的目标多核苷酸同时整合到真菌宿主细胞的染色体中的方法，所述方法包括以下步骤：（a）提供在其染色体内包括至少两个整合位点的真菌宿主细胞，每个整合位点包括一对位点特异性重组酶的识别序列，每对识别序列位于驻留阴性选择标记的两侧；（b）向所述细胞中引入核酸构建体，所述核酸构建体包括一对所述位点特异性重组酶的识别序列，所述识别序列对位于所述目标多核苷酸的两侧；（c）在所述细胞中短暂表达所述位点特异性重组酶，借此染色体的识别序列对通过所述重组酶与所述核酸构建体的对应的识别序列对重组，从而使得在所述至少两个整合位点，所述染色体中的驻留阴性选择标记被切除而所述目标多核苷酸的拷贝整合到它的位置上，产生包括两个或更多个拷贝的整合到所述真菌宿主细胞的染色体中的所述目标多核苷酸的真菌宿主细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：宇田川裕晃，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：
国别省市：
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