本发明专利技术涉及一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而表达外源多肽的方法。揭示了一种通过在甲醇营养型酵母细胞内增加Mit1多肽的表达量，激活需要甲醇诱导的启动子表达，以此使得原本依赖甲醇诱导的启动子不再依赖单一甲醇也可表达外源多肽。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域；更具体地，本专利技术涉及一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而表达外源多肽的方法。
技术介绍
甲醇营养型酵母(包括Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis 等)表达系统由于其高效的外源多肽表达能力已经在工业生产、制药等领域被非常广泛的运用。其特点在于，它们拥有能够被甲醇高效诱导的启动子(A0X1启动子、DHAS启动子、FDH启动子、MOX启动子、A0X2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子等)，并且这些启动子严格依赖甲醇，其它碳源(如葡萄糖，甘油等)会抑制这些启动子的表达。随着石油危机的爆发，利用甲醇生产单细胞蛋白，成本变高。之所以利用甲基营 养型母酵母表达系统表达如此之多的外源多肽，是因为其具有其他表达系统不可比拟的优势基因操作简单，外源多肽表达量高，既可以胞内表达，也可以分泌表达；外源多肽基因遗传稳定；作为真核表达系统，具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能；由于被利用的范围越来越广，在实际的发酵放大过程中遇到很多问题(1)表达所用的启动子需要甲醇的诱导，甲醇有毒易燃，在大规模工业发酵中需要进行特别的防暴设计；(2)甲醇发酵强耗氧，一般靠增大空气的通气量和提高转速很难满足氧气的需求而需要通纯氧，甲醇代谢需要氧气的量是葡萄糖为碳源所需氧气量的三至四倍。消耗的甲醇越多需要的纯氧越多，这给实际的工业化生产带来很大的麻烦。另外消耗的甲醇越多所产的热量也越大，所需设备的冷却能力要求越高；(3)甲醇作为一种石油化学产品，不适合于一些食品领域添加剂的生产；(4)甲醇代谢会产生H2O2，会导致所表达多肽的水解。因此，如果得到一种能够利用非甲醇诱导甲醇诱导型启动子表达的方法，使原本依赖甲醇诱导的启动子的高效转录不依赖于甲醇，而可用其他碳源来诱导这些启动子的表达，这对于实现工业上利用非甲醇高效表达外源多肽具有积极意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动甲醇诱导型启动子表达外源多肽的方法。本专利技术的另一目的还在于提供重组的甲醇营养型酵母，其可以利用消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性来表达外源多肽。在本专利技术的第一方面，提供一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达的方法，包括(I)提供甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有表达盒1，其表达外源的Mitl多肽；以及表达盒2，包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因；(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下培养(I)的甲醇营养型酵母。在一个优选例中，所述的Mitl多肽是转录激活相关因子，使得原本依赖甲醇诱导的启动子不再依赖甲醇也可表达外源多肽。在另一优选例中，所述的Mitl多肽的功能为激活甲醇代谢中需要甲醇诱导的启动子表达。在另一优选例中，所述的Mitl是PpMitl。在另一优选例中，所述表达盒2在甲醇营养型酵母中以单拷贝或多拷贝存在，例如 1-20 拷贝，如 15，10，8，6，5，3，2 拷贝。 在另一优选例中，所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于)A0X1启动子、DHAS启动子、DAS启动子、FDH启动子、FMDH启动子、MOX启动子、A0X2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子、PMP20启动子、PMP47启动子、AODl启动子、A0D2启动子。在另一优选例中，所述的甲醇营养型酵母包括(但不限于)毕赤酵母(Pichia),汉逊酵母(Hansenula),假丝酵母(Candida),球拟酵母(Torulopsis);较佳地，所述的毕赤酵母(Pichia)包括(但不限于)GS115，MIGl基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Amigl Amig2)，NRGl基因、MIGl基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Amigl Amig2 Δ nrgl),或HXSl基因不表达的毕赤酵母菌株。在另一优选例中，述的Mitl多肽选自下组(a) SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1_30个，更佳地1_20个，更佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)与(a)限定的序列在具有70%以上(较佳地80%以上，更佳地90%以上，更佳地95%以上，更佳地98%以上，如99%或更高)的序列相同性的，且具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的Mitl多肽的编码基因的NCBI Reference Sequence为XM_002493021. I。在另一优选例中，所述的Mitl多肽的编码基因具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的Mitl多肽的编码基因在甲醇存在的情况下诱导表达，在甘油、葡萄糖等碳源存在的情况下不表达。在另一优选例中，所述的表达盒I中，包括启动子以及与之操作性连接的Mitl多肽的编码基因；较佳地，该启动子包括(但不限于)组成型启动子，诱导型启动子，组织或器官特异性启动子，时空特异性表达启动子。在另一优选例中，表达盒I中，所述启动子包括(但不限于)GAP启动子、PGKl启动子、MITl启动子等任意能使MITl过表达的启动子。在另一优选例中，所述的表达盒I在甲醇营养型酵母中以单拷贝或多拷贝存在，例如1-20拷贝，如15，10，8，6，5，3，2拷贝。在另一优选例中，步骤(2)中，采用存在甘油和/或葡萄糖的酵母培养基。在本专利技术的另一方面，提供Mitl多肽或其编码基因的用途，用于消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达。在本专利技术的另一方面，提供一种重组的甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有表达盒1，其能够表达外源的Mitl多肽；以及表达盒2，包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因。在一个优选例中，所述的甲醇营养型酵母包括(但不限于)毕赤酵母(Pichia),汉逊酵母(Hansenula),假丝酵母(Candida),球拟酵母(Torulopsis);较佳地，所述的毕赤酵母(Pichia)包括(但不限于)GS115，MIGl基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Amigl Amig2)，NRGl基因、MIGl基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Amigl Amig2 Δ nrgl),或HXSl基因不表达的毕赤酵母菌株。 在一个优选例中，所述的所述的MIGl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述的MIG2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；或所述的HXSl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。所述的NRGl基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示(NCBI ReferenceSequence:XM_002493138. I)。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图I、pGAPZ a A的质粒图谱示意图。图2、载体pAG32的质粒图谱示本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达的方法，包括：(1)提供甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：表达盒1，其表达外源的Mit1多肽；以及表达盒2，包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因；(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下培养(1)的甲醇营养型酵母。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周祥山，张元兴，王锦佳，王小龙，柏鹏，张平，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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