本发明专利技术公开一种中华绒螯蟹HSP90基因克隆及其应用，所述的基因具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。该基因所编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明专利技术所述的HSP90基因是首次从中华绒螯蟹肝胰脏中扩增得到，其可用于HSP90基因的体外重组表达和基因转移，为医药产品开发，遗传选育和改良，增强应对高温、低温、重金属离子超标及病原菌感染等抗逆奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中华绒螯蟹一种热激蛋白90(HSP90)基因cDNA全长序列的扩增及原核表达等。
技术介绍
中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，又名河蟹、毛蟹、大闸蟹，在我国广泛分布于辽河、黄河、长江、瓯江和闽江等江河流域，是我国最主要的经济蟹类之一，也是我国蟹类中产量最多的淡水蟹。其生长快、肉质细嫩、味道鲜美，是我国重要的经济水产养殖品种，该蟹的养殖已成为我国水产养殖的支柱产业。但随着我国工业化进程的加快，中华绒螯蟹的养殖水体中重金属离子、有害病原菌超标问题越来越突出，导致该蟹病害等问题也越来越严重，已成为制约中华绒螯蟹养殖业可持续健康发展的主要问题。热激蛋白(HeatShockProtein，HSP)是一种在应对高温和低温、重金属离子超标、病原微生物感染等应激条件下细胞产生的对自身起保护作用的蛋白质。根据其分子量的大小可分为不同的蛋白家族，其中热激蛋白90(HSP90)是与信号传导途径中的苏氨酸蛋白激酶、络氨酸蛋白激酶和丝氨酸、类固醇激素受体等分子结合，调节它们之间的生物活性，防止蛋白质的聚集和热变性的一类基因家族。HSP90对细胞的凋亡、免疫作用及其肿瘤的发生发展有十分重要的影响；同时，HSP90在抵抗病原的入侵、调节机体免疫力以及机体衰老过程中也发挥着重要作用。鉴于HSP90的众多重要功能及其与机体多种损伤、感染等的关系不断被阐明，近年来，对水生动物HSP90基因序列、蛋白功能等研究引起了广泛关注，其中包括多种水生甲壳类动物HSP90基因的研究。有研究表明，甲壳动物的该基因在受到环境或者病原胁迫时发生热休克反应而被诱导表达，参与相关免疫应激反应。HSP90包含不同的家族成员，宋林生研究员和李鹏博士分别公布了中华绒螯蟹cDNA全长为2506bp和2517bp的HSP90α基因，经比对，这两个基因相似性98％，是同一个基因。并且李鹏博士还对该基因的结构、特征和不同发育阶段的表达水平进行了分析。黄安明在拟穴青蟹中发现了HSP90家族的β亚型基因：HSP90β(GenBank号：JX987068)，发现该基因全长3023bp，包含2373bp的开放阅读框，经菌刺激后表达分析证明，该HSP90参与机体抗菌及病毒免疫应激反应，在先天免疫系统中发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术旨在从中华绒螯蟹中扩增得到HSP90基因，更为具体地说，是HSP90β基因，并期望通过该基因在制备中华绒螯蟹免疫学药品、分子标记辅助育种等的应用，为中华绒螯蟹抗逆新品种选育提供理论及数据支持。本专利技术首先提供一种中华绒螯蟹HSP90基因克隆，具有SEQIDNO.1所示的碱基序列。本专利技术利用PCR扩增、5′RACE和3′RACE技术，对中华绒螯蟹HSP90基因进行了研究，首次从中华绒螯蟹中扩增到上述具有SEQIDNO.1所示的碱基序列的HSP90基因的cDNA全长序列，该基因cDNA全长3142bp，5′UTR为64bp，3′UTR为711bp，有一个2367bp开放阅读框，编码788个氨基酸。其编码蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。制备上述本专利技术的中华绒螯蟹HSP90基因克隆的方法包括以中华绒螯蟹的cDNA为模板，SEQIDNO.3/SEQIDNO.4为引物进行PCR扩增的步骤。进一步地，该克隆方法包括如下步骤：①从中华绒螯蟹的肝胰脏提取cDNA模板；②构建PCR扩增体系：cDNA模板1μL，2.5mmol/L的dNTPMixture4μL，10μmol/L的上下游引物各1μL，10×Buffer2.5μL，5U/μL的LATaq酶0.25μL，加灭菌超纯水至总体积25μL；③SEQIDNO.3/SEQIDNO.4为引物PCR扩增：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min，SEQIDNO.3:CCTGGGACTGGACTCTGGTA；SEQIDNO.4:CCTTTGGTTGGTGGGTCG；④3′RACE和5′RACE扩增。具体的实施方式中，所述的3′RACE和5′RACE扩增分别使用碱基序列为SEQIDNO.5/6、SEQIDNO.7/8的引物对。SEQIDNO.5:TGAGACGAAGGATTTGGTGC；SEQIDNO.6:TGTGTATGCGTTCGCTGGT；SEQIDNO.7:GCTGCTTGTCAGAGTTGTGTTTGGA；SEQIDNO.8:CATTTGTGCTACATTGAGTCCGTCC。另一方面，本专利技术提供一种重组中华绒螯蟹HSP90基因的质粒，该质粒是将上述本专利技术的中华绒螯蟹HSP90基因克隆片段连接至表达载体pET-15b中所构建的重组表达质粒。再一方面，本专利技术的目的在于构建一种表达中华绒螯蟹HSP90的基因工程菌，所述基因工程菌是以上述重组中华绒螯蟹HSP90基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞所获得的重组基因工程菌。即将SEQIDNO.1的碱基序列所对应的基因片段连接至表达载体PET-15b中，构建重组表达质粒。并将所得的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞获得重组基因工程菌。再一方面，本专利技术提供所述中华绒螯蟹HSP90基因克隆的应用，所述应用包括但不限于其在制备中华绒螯蟹免疫学药品中的应用，以及其在中华绒螯蟹抗逆新品种选育中的应用。本专利技术还可以根据序列表SEQIDNO.1的序列设计PCR和RT-PCR引物，对中华绒螯蟹不同规格和不同地理群体的HSP90基因的部分序列进行扩增和序列测定，比较不同个体在HSP90基因序列上的差异，同时比较不同规格和地理群体的HSP90基因mRNA表达的差异，以此指导中华绒螯蟹的遗传选育。本专利技术利用PCR扩增技术、cDNA5′和3′快速扩增技术(RACE)从中华绒螯蟹中克隆得到了HSP90基因，可用于HSP90基因的重组表达和基因转移，并为中华绒螯蟹增强抗逆境能力、基因辅助选育及进一步开发为药物产品奠定基础。所述的中华绒螯蟹HSP90基因的序列可在中华绒螯蟹遗传选育中应用；也可在细菌、酵母和昆虫细胞系的表达；例如：克隆到pQE系列、pET等系列表达载体中，再将构建成的重组表达载体转化大肠杆菌和酵母，筛选阳性克隆并以IPTG诱导重组蛋白的表达。利用亲和层析对表达产物进行多级纯化，获得体外重组表达的中华绒螯蟹HSP90。所表达的重组蛋白产品可作为药物、饲料添加剂使用。本专利技术所公开的中华绒螯蟹HSP90基因(SEQIDNO.1)及其相关产品和技术在医药产品制备、中华绒螯蟹免疫学研究、遗传选育和改良等方面有广阔的应用前景。附图说明本专利技术附图8幅，分别是：图1是中华绒螯蟹HSP90基因表达分布，图中：1.眼柄、2.肌肉、3.心、4.血细胞、5.肠、6.鳃、7.胃、8.肝胰脏、9.Y器官。图2是金黄色葡萄球菌刺激后不同时间段HSP90基因表达量变化，其中：横坐标是相对表达量，纵坐标是时间(小时)。图3是鳗弧菌刺激后不同时间段HSP90基因表达量变化，其中：横坐标是相对表达量，纵坐标是时间(小时)。图4是融合蛋白诱导结果的SDS-PAGE照片，其中，M：ProteinMarker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。图5本文档来自技高网...
【技术保护点】
中华绒螯蟹HSP90基因克隆，其特征在于：具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
【技术特征摘要】
1.中华绒螯蟹HSP90基因克隆，其特征在于：具有SEQIDNO.1所示的碱基序列。2.中华绒螯蟹热激蛋白，其特征在于：具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。3.一种重组中华绒螯蟹HSP90基因的质粒，其特征在于，是将权利要求1所述的中华绒螯蟹HSP90基因克隆片段连接至表达载体pET-15b中所构建的重组表达质粒。4.一种表达中华绒螯蟹HSP90的基因工程菌，其特征在于，是以权利要求3所述的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞所获得的重组基因工程菌。5.制备权利要求1所述的中华绒螯蟹HSP90基因克隆的方法，其特征在于，包括以中华绒螯蟹的cDNA为模板，SEQIDNO.3/SEQIDNO.4为引物进行PCR扩增的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：①从中华绒螯蟹的肝胰脏提取cDNA模板；②构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：高祥刚，高磊，鲍相渤，赫崇波，刘卫东，苏浩，李云峰，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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