本发明专利技术涉及一种抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株ES，保藏号为：CCTCCNO:C201414，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2014年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。该单克隆抗体能与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合。本发明专利技术通过流式细胞仪分选血细胞得到的中华绒螯蟹颗粒血细胞，经细胞裂解得颗粒血细胞细胞膜蛋白，通过电泳切胶回收提纯颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合方法制备杂交瘤细胞，经免疫学检测方法筛选出抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体，然后采用免疫学鉴定方法鉴定其特性。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株ES，保藏号为：CCTCCNO:C201414，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2014年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。该单克隆抗体能与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合。本专利技术通过流式细胞仪分选血细胞得到的中华绒螯蟹颗粒血细胞，经细胞裂解得颗粒血细胞细胞膜蛋白，通过电泳切胶回收提纯颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合方法制备杂交瘤细胞，经免疫学检测方法筛选出抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体，然后采用免疫学鉴定方法鉴定其特性。【专利说明】
本专利技术涉及一种由杂交瘤细胞分泌的抗中华绒螯蟹(iZr1cAeir颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体及其制备方法，属于蟹类细胞免疫学
。
技术介绍
蟹类不具有高等动物完善的特异性免疫系统，缺乏免疫球蛋白，其免疫防御反应主要依赖血细胞及血淋巴中的酶和免疫因子完成。研究表明血细胞可利用吞噬、包埋、伤口修复、渗透调节、胞吐、自溶等方式识别清除外来异物，通过合成释放凝集素、溶菌素、水解酶、氧化酶等协助完成体液免疫过程，在蟹类抵御外界环境刺激和外来病原物入侵过程中发挥关键作用。目前根据细胞化学、形态学及功能方面将蟹类血细胞分为两大类:颗粒血细胞和透明血细胞。颗粒血细胞胞质颗粒较多，核质比小，而透明血细胞胞质颗粒较少或没有，核质比大；此外，两类细胞在功能上有所区别，通常情况下，颗粒血细胞能够释放溶菌酶、吞噬素、酚氧化酶、葡糖苷酸酶等，透明血细胞能够产生活性氧，可以直接参与对外来异物的吞噬。因为尚无合适的分子标记物跟踪水产蟹类体内两类血细胞的发生和参加免疫反应的过程，故目前在蟹类两类血细胞的功能和发生过程等研究方面并无确切定论。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、性质均一等特点在免疫细胞的研究中早已应用，但在水产蟹类血细胞的研究中应用较少，因此中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白单克隆抗体的制备为研究颗粒血细胞在中华绒螯蟹非特异性免疫系统中的作用提供了有力工具；利用该单抗可验证其它虾蟹类动物血细胞是否具有共同抗原决定簇，此外，研究表明，蟹类受外来病原和环境刺激时，其血细胞总数会发生显著变，以中华绒螯蟹颗粒血细胞单克隆抗体为基础建立的酶联免疫检测技术， 可以通过监测水产养殖生产中蟹类血细胞数量的变化，进而评估生产实践中中华绒螯蟹体质及抗逆状况。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体。 本专利技术另一个目的是提供上述抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体的制备方法。 本专利技术的目的是由以下技术方案实现的:一种抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体,其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为:杂交瘤细胞株ES，保藏号为:CCTCC NO: C201414，保藏单位为:中国典型培养物保藏中心，地址:湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为:2014年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。倒置显微镜下观察该杂交瘤细胞生长状态良好，表现为:细胞透亮、个体浑圆、外观饱满、大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞具有无限分裂增殖能力；常规条件下培养该杂交瘤细胞，当培养液颜色由桃红色转为黄色，培养液中即含有该杂交瘤细胞分泌的抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体。 该单克隆抗体能与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合，与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于中华绒螯蟹颗粒血细胞分子量为30.9kDa的蛋白上。 —种所述抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤如下:抽取中华绒螯蟹血淋巴，离心得到全血细胞；全血细胞经流式细胞仪分选得到中华绒螯蟹颗粒血细胞；颗粒血细胞经细胞裂解液、超声波破碎、离心得颗粒血细胞细胞膜蛋白；以中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白为样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对30.9kDa蛋白条带进行蛋白提纯；以提纯的中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白作为抗原，免疫Balb/C小鼠；取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；间接酶联免疫吸附法筛选阳性杂交瘤细胞株；对阳性杂交瘤细胞株进行克隆，最后筛选得到一株能稳定分泌抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株ES ;其分泌的抗体为抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体(简称:单抗ES)，经激光共聚焦法、流式免疫荧光法和转印免疫印迹法验证其特性。 所述的流式细胞仪分选血细胞是将中华绒螯蟹全血细胞经流式细胞仪分选，得到的两团细胞中居散点图中间的一团即为颗粒血细胞。 所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫吸附法，将融合杂交瘤细胞上清液分别与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白反应，而后加入碱性磷酸酶(AP)标记羊抗小鼠IgG抗体，酶标仪OD492nm条件下记录、筛选抗颗粒血细胞细胞膜的单克隆抗体，即杂交瘤细胞株ES。其中结合中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液的流式免疫荧光，颗粒血细胞血滴片激光共聚焦反应结果和转印免疫印迹法综合确定:该单抗与中华绒螯蟹蟹颗粒血细胞细胞膜发生特异性结合反应。 所述的免疫学鉴定方法是流式免疫荧光法、激光共聚焦法和转印免疫印迹法，流式免疫荧光法是将制备的单克隆抗体与中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液反应，而后避光条件下加入异硫氰荧光素(FITC)标记羊抗小鼠IgG抗体，流式细胞仪检测验证制备的单克隆抗体为抗中华绒螯蟹颗粒血细胞的单克隆抗体；激光共聚焦法是将单抗ES与中华绒螯蟹颗粒血细胞血滴片反应，而后避光条件下加入异硫氰荧光素(FITC)标记羊抗小鼠IgG抗体，激光共聚焦显微镜检测验证制备的单克隆抗体为抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜的单克隆抗体；转印免疫印记法是将凝胶蛋白进行电转移至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜浸入制备的单克隆抗体中，而后将其浸入碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗小鼠IgG抗体中，发色液显色观察条带，确定抗原决定簇的分子量。其中中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液流式免疫荧光，中华绒螯蟹颗粒血细胞血滴片结果结合转印免疫印迹法结果能够确定单抗ES与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合反应，且该单抗的抗原决定簇位于分子量为30.9kDa的中华绒螯蟹颗粒血细胞蛋白上。 本专利技术的优点在于:本专利技术制备技术路线是通过流式细胞仪分选血细胞得到的中华绒螯蟹颗粒血细胞，经细胞裂解得颗粒血细胞细胞膜蛋白，通过电泳切胶回收提纯颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合方法制备杂交瘤细胞，经免疫学检测方法筛选出抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体，然后采用免疫学鉴定方法鉴定其特性，此技术路线设计缜密，充分利用多种免疫学检测方法发挥其筛选鉴定的作用。本专利技术采用了间接酶联免疫吸附法筛选杂交瘤细胞株，该法利用酶标抗体作为第二抗体，反应快速灵敏，可检测大量样品，有效节约时间。同时，本专利技术采用流式免疫荧光法验证单抗特性，流式细胞术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株ES，保藏号为：CCTCC NO: C201414，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2014年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程顺峰，邓灯，吴晓春，张敏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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