加强钝齿棒杆菌NAD激酶表达在高低供氧条件下提高该菌株L-精氨酸生产能力的方法技术

本发明专利技术加强钝齿棒杆菌NAD激酶的表达，以提高该菌株的L-精氨酸生产能力。在高供氧的条件下，NAD激酶活性提高了86.2%，NADP+及NADPH分别提高了7.30%及36.84%，L-精氨酸产量提高了12%；在低供氧的条件下，NAD激酶活性提高了34.8%，NADP+及NADPH分别提高了14.67%及15.0%，L-精氨酸产量提高了38.5%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种加强钝齿棒杆菌NAD激酶表达，在高低供氧条件下提高该菌株L-精氨酸生产能力的方法。
技术介绍
L-精氨酸(L-Arginine，简称L-Arg)作为一种半必需氨基酸，是合成蛋白质、磷酸肌酸的重要原料，也是生物体内尿素循环的重要中间产物，具有重要的生理功能和应用价值，广泛应用于食品、化工和医药等领域。由于精氨酸具有特殊的应用价值，所以国内需求量巨大，采用发酵法生产L-精氨酸具有环保、经济等优点，所以构建高产L-精氨酸工程菌株对于实现发酵法生产L-精氨酸工业化生产具有重要意义。NADPH是生物体中一种重要的辅酶，作为电子供体，其为氧化还原反应提供还原动力，而且对于细胞抗活性氧的毒害起到重要作用。NAD激酶催化NAD+与ATP反应生成NADP+与ADP，这是NADP+生物合成的最后一步，也是限速步骤，而NADP+通过还原反应生成NADPH，其在生物体内发挥重要的生理功能。谷氨酸棒杆菌作为氨基酸生产菌株，其发酵生产各种氨基酸需要在高溶氧的环境下进行，提供充足的NADPH对于缓解菌体所处的氧胁迫的环境具有重要意义。NADPH作为一些氧化还原反应中的辅酶，在氨基酸生物合成过程中起到了重要作用。在L-精氨酸生物合成途径中需要NADPH的参与(I)由a-酮戊二酸经谷氨酸脱氢酶(识*)合成L-谷氨酸需一分子NADPH; (2)由N-乙酰谷氨酸磷酸经乙酰谷氨酸半醛脱氢酶合成N-乙酰谷氨酸-5-半醛需要一分子NADPH，所以增加菌体生产NADPH能力对于提高其L-精氨酸生产能力具有重要意义。在谷氨酸棒杆菌中NADP+的还原主要通过脱氢酶催化来实现，其中主要由磷酸戊糖途径(PPP途径)中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH/af/)及6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH/>/m0提供，另外一小部分由TCA循环中的异柠檬酸脱氢酶(I⑶/ict/)，苹果酸酶(MEA a7万)，其中由G6PDH提供的NADPH占细胞总量的70%以上，而G6TOH是PPP途径中的限速酶，该途径的代谢流受到/比例的调控。所以通过加强NAD激酶的表达增加NADP+含量，从而调控PPP途径的流量，进而增加胞内NADPH的含量是有效的方法。通过加强酶或破坏酶基因的表达来提高菌株对于目标产物的生产能力是代谢工程的主流手段，除此之外，一些研究通过改变辅酶(如NADPH)的水平来改变菌株对目标产物的生产能力，并应用于大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌中。NADPH作为氨基酸生物合成途径中重要的辅酶因子，通过应用代谢工程手段增强PPP途径或加强NADPH合成的相关基因的表达来增加NADPH的供应，对于提高菌株氨基酸生产能力具有积极的作用。据相关文献报道，在谷氨酸棒杆菌中通缺失葡萄糖磷酸异构酶、加强G6TOH的表达、克隆表达大肠杆菌中关于NADPH合成的相关基因等可有效提闻菌株L-赖氣酸的生广能力。钝齿棒杆菌是我国研究者分离得到的一株短棒状、革兰氏阳性菌株。其突变株在国内氨基酸工业中 得到广泛的应用。钝齿棒杆菌SYPA是本实验室通过多级复合诱变筛选获得的一株L-精氨酸高产菌株，其在高供氧的条件下发酵产L-精氨酸。作为一株高产L-精氨酸的菌株，其需要大量NADPH来提供还原动力，同时需要充足的NADPH作为电子供体缓解氧自由基可能对微生物产生的损伤作用。本专利技术通过加强表达NADPH生物合成的限速酶(NAD激酶)来增加胞内NADPH的供应，一方面保证充足的NADPH为L-精氨酸生物合成提供还原动力；另一方面缓解高供氧发酵条件可能对菌株产生的氧胁迫。通过这种方法来增加钝齿棒杆菌生产L-精氨酸的能力。
技术实现思路
本专利技术提供了通过加强钝齿棒杆菌NAD激酶表达在高低溶氧条件下提高该菌株L-精氨酸生产能力的方法。从钝齿棒杆菌SYPA中扩增编码NAD激酶的基因，与含有tac启动子的穿梭表达质粒pJC-tec连接，电击转化入钝齿棒杆菌SYPA中，构建重组菌株，来增强该菌株的NAD激酶的表达量，从而增加胞内NADP+及NADPH的含量，进而提高L-精 氨酸的产量。具体专利技术方案如下1.重组菌株SY k/dtac-ppnK的获取 克隆钝齿棒杆菌SYPA基因组上的基因，构建表达质粒将该重组穿梭质粒通过电击转化的方法转入钝齿棒杆菌中，获得重组钝齿棒杆菌 >Y k/WC-tac-ppnK。(I)穿梭质粒WC-tac-ppnK质粒的构建 依据NCBI中公布的谷氨酸棒杆菌中编码NAD激酶的ppnK的基因序列(GenBank NC_006958)，利用其同源性，设计引物扩增钝齿棒杆菌中的基因。引物设计如下ppnK F Xba1:5’ -GCTCTAGAATGACTGCACCCACGAACG-3’ppnK R Sal1:5’ -GCGTCGACTTACCCCGCTGACCTGG-3’ 以钝齿棒杆菌基因组为模板，以V RppnK R为引物，扩增两端酶切位点分别为Xbal I及Sal I的基因片段，PCR产物经过纯化后与pMD 19_T vector连接，转入E. coli JM 109中保存质粒。从含Amp的平板上挑取单菌落，提取质粒经单、双酶切验证，并测序。对于成功与目的基因连接的质粒，与pJC-toc用相同限制性内切酶进行双酶切，经纯化后连接，获得pJC-tac-ppnk重组质粒。(2)重组菌株 SWk/v]C-tac-ppnK 的构建 提取质粒通过电击转化的方法转化入钝齿棒杆菌中，涂布于含50ug/L的Kan平板上，于30°C条件下培养36h，挑取转化子，于含Kan的液体培养基中培养后，提取质粒验证。2.重组菌株发酵评价 采用250mL的摇瓶对钝齿棒杆菌进行发酵培养，设定两个不同供氧模型，即装液量分别为20mL、60mL/250mL，分别考察不同供氧条件下，重组菌株与出发菌株发酵过程各项参数的差异，评价NAD激酶增强表达对菌株生长、L-精氨酸生产及碳源消耗的影响。发酵方法如下 摇瓶种子培养基(g L—1):葡萄糖30，酵母粉10，尿素1.5，(NH4)2SO4 20, KH2PO4 1，MgSO4 7H20 0. 5。NaOH 调 pH7. 0 7. 2，装液量 30 mL/250 mL。115°C灭菌 7min 摇瓶发酵培养基(g L-1):葡萄糖150，酵母粉10，KH2PO41. 5，(NH4)2SO4 50，MnSO4 H2O 0. 02, MgSO4 7H20 0. 5，FeSO4 7H20 0. 02，L-His 5.0X10_4，生物素 8X1(T5，轻质 CaCO3 30。NaOH调 pH7. 0 7. 2，装液量 20 mL/250 mL 或 60 mL/250 mL，115°C灭菌 7 min。培养方法将保存菌种与含糖肉汤培养基斜面划线，于30°C恒温生化培养箱中培养约20_24h,从斜面上挑取一环菌接种于摇瓶种子培养基,于30°C 120rpm/min往复式摇床上培养14-16h至0D562约为15-18，按5%的接种量接种于摇瓶发酵培养基，于30°C120rpm/min往复式摇床上培养24_36h,补加5%的葡萄糖,至发酵结束共培养96h。发酵参数测定方法 A.菌体生长以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高钝齿棒杆菌SYPA在高低供氧条件下生产L?精氨酸生产能力的方法，其特征为，通过加强钝齿棒杆菌SYPA的NAD激酶表达，以提高该菌株的L?精氨酸生产能力。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，赵芹芹，窦文芳，饶志明，史劲松，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：