本发明专利技术公开了一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌，所述载体包括：在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列，能表达导肽蛋白序列的DNA序列和CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。白喉杆菌携带的在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，因其具有在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列，因而可以使得表达载体在白喉杆菌中稳定复制，同时表达载体上的能表达导肽蛋白序列的DNA序列可以使得表达的CRM197重组蛋白进行分泌表达并分泌到胞外，从而使得CRM197重组蛋白的表达量得到提高，使得表达的CRM197重组蛋白的纯化工艺进一步简化，提高了蛋白得率，节约了生产时间和成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种疫苗生产菌株领域，具体涉及ー种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及携帯该载体的白喉杆菌。
技术介绍
白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)是引起小儿白喉的病原菌，属于棒状杆菌属(Corynebacterium),其生长周期短,繁埴速度快。白喉杆菌的致病物质主要是白喉毒素，白喉毒素以分泌型表达方式存在于胞质夕卜，且白喉杆菌其胞质外的分泌蛋白除白喉毒素外，其他杂蛋白含量极小，其对于白喉毒素的纯化十分有利，因此白喉杆菌广泛的应用于疫苗发酵生产中作为白喉毒素和白喉毒素突变体(CRM197)的生产工程菌株。而目前多采用的用于抗原发酵生产的表达体系有大肠杆菌，植物细胞等，其缺点 是杂蛋白含量较高，多为胞内或包涵体内表达，对于后期的纯化工艺有很高的时间和人力，物力成本；而分泌型的表达系统的建立多需要引导肽的引入，但往往其要求与抗原蛋白融合表达，则需要在后期エ艺中对引导肽进行切除处理，増加了エ艺的复杂度和操作的难度。至今未有报道利用白喉杆菌携帯可复制质粒用于抗原表达的研究和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体。本专利技术的第二个目的是提供一种携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。本专利技术的第三个目的是提供一种重组CRM197蛋白的表达方法。本专利技术的技术方案概述如下一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，所述载体包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO. 2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQIDN0. 3所示的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。一种携带上述在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。一种重组CRM197蛋白的表达方法，包括如下步骤a.将在白喉杆菌中稳定复制的表达载体通过结合转移的方法导入宿主白喉杆菌中；b.筛选得到携帯在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌；c.将步骤b获得的白喉杆菌进行蛋白表达和分泌，得到重组CRM197蛋白；所述在白喉杆菌中稳定复制的表达载体包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO. 2所不导妝蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所不的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。所述宿主白喉杆菌优选编号为ATCC39255的白喉杆菌，ATCC43145的白喉杆菌或CMCC38007白喉杆菌。本专利技术的优点是白喉杆菌携帯的在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，因其具有在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列，因而可以使得表达载体在白喉杆菌中稳定复制，同时表达载体上的能表达导妝蛋白序列的DNA序列可以使得表达的CRM197重组蛋白进行分泌表达并分泌到胞外，从而使得CRM197重组蛋白的表达量得到提高，使得表达的CRM197重组蛋白的纯化工艺进ー步简化，提高了蛋白得率，节约了生产时间和成本。附图说明图I为ー种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体pCKM5. I酶切鉴定图谱。图2为携带pCKM5. I的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)高效分泌表达蛋白 CRM197SDS-PAGE 图谱。图3为携带pCKM5. I的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)发酵制备CRM197蛋白的 SDS-PAGE 图谱。(I Al 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8 A8 9Marker)图4为携带pCKM5. 2的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)高效分泌表达蛋白CRM197SDS-PAGE 图谱。图5为携带pCKM5. 2的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)发酵制备CRM197蛋白的 SDS-PAGE 图谱。(I Al 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8Marker)具体实施例方式下面实施例中的方法若无特殊说明均为常规方法。下面各实施例所涉及的白喉杆菌均为购买所得。白喉杆菌(CMCC38007，中国医学细菌保藏管理中心，Pff8)下面结合具体实施例对本专利技术作进ー步的说明。实施例I在白喉杆菌中稳定复制的表达载体pCKM5. I的构建引物设计，PCR扩增目的抗原基因CRM197设计引物序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5，以白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)基因组DNA为模板，PCR反应程序如下(I) 95°C，3分钟；(2) 98°C，30秒，60°C，30秒，72°C，30秒，30循环；(3)72°C，2分钟。反应结束后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。经纯化回收的PCR产物通过T/A克隆连接于T载体pEASY-Tlsimple上，转化大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆提取质粒，通过XhoI和SalI双酶切将目的抗原基因CRM197切下插入到pCKM4. I (SEQ ID NO. 6)中的SalI位点上，得到重组质粒，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆并提取质粒，分别利用NheI，BglII和SalI进行酶切鉴定，其酶切鉴定图谱如图I所示，图I中泳道I为Markerlk plus，泳道2为经NheI酶切的重组质粒的酶切片段，泳道3为BglII和SalI双酶切的重组质粒酶切片段。对于酶切鉴定正确的重组质粒进行针对性测序，结果表明插入的目的抗原基因(CRM197重组蛋白编码基因)的核苷酸序列(SEQ IDNO. 3)经分析与原序列(參考文献1)99%吻合，其编码的氨基酸序列100%吻合。将测序包含有SEQ ID NO. 3的重组质粒命名为pCKM5. I (SEQ ID NO. 7所示)(分别从6967-9646为SEQ ID NO. I、1666-1740 (反向编码)为SEQ ID NO. 2的DNA编码序列、5-2091 (反向编码)SEQ ID NO. 3)。实施例2、pCKM5. I在白喉杆菌中表达CRM197将实施例I中获得的表达质粒PCKM5. I电转化至大肠杆菌s-17中，通过结合转移转化至白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)中，经筛选得到携帯有稳定复制表达质粒pCKM5. I的白喉杆菌菌落，接种于IOOml白喉杆菌培养基(ATCC medium: 1417Low IronYCmedium)中(含有25ug/ml的卡那霉素)，37 °C，250rpm摇床上培养待测定0D_至15-18后，离心收集上清，在每IOOml离心上清中加入45g硫酸铵，4°C沉淀，离心收集沉淀，用30mlTris-HCL pH=8. 0水溶液重悬后进行SDS-PAGE电泳分析，并以无任何质粒的白喉杆菌菌体上清作为对照。如图2所示，泳道I为protein marker I，泳道2，3为对照组野生型白喉杆菌分别在0. lg/L，lg/L游离铁离子浓度下的分泌上清，泳道4，5为携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载体PCKM5. I的白喉杆菌菌株分别在0. lg/L，lg/L游离铁离子浓度下的分泌上清。经SDS-PAGE分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，其特征是所述载体包括：由SEQ？ID？NO.1所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ？ID？NO.1所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ？ID？NO.2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQ？ID？NO.3所示的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，其特征是所述载体包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO. 2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所不的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。2.一种携带权利要求I在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。3.一种重组CRM197蛋白的表达方法，其特征是包括如下步骤 a.将在白喉杆菌中稳定复制的表达载体通过结合转移的方法导入宿主白喉杆菌中； b.筛选得到携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱涛，段磊，宇学锋，邵忠琦，毛慧华，邱东旭，
申请(专利权)人：天津康希诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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