腐殖质还原棒杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种腐殖质还原棒杆菌及其应用。所述腐殖质还原棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ?ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）通过对污泥微生物燃料电池的阳极液进行分离纯化得到的，于２００８年４月１４日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．２４５２。本发明专利技术所述腐殖质还原棒杆菌在厌氧条件下的电子供体利用谱较广，具有碱性条件下高效的腐殖质还原能力及产电能力，可广泛应用于有机污染物的原位生物修复、微生物燃料电池发电技术或高浓度有机废弃物的资源化处置。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境与新能源
，具体涉及一株具产电及腐殖质呼吸活性的腐 殖质还原棒杆菌及其应用。
技术介绍
腐殖质呼吸是近年来倍受关注的新型微生物能量代谢方式。腐殖质呼吸，又称醌 呼吸，是指微生物以腐殖质为末端电子受体，通过氧化电子供体偶联腐殖质还原，并从这一 过程中贮存生命活动的能量。能进行腐殖质呼吸的微生物称为腐殖质还原菌。目前，腐殖 质呼吸的环境重要性已被广泛接受与认同腐殖质呼吸不仅与碳、氮、磷等元素的自然循环 过程相偶联，而且还显著影响重金属与有机污染物还原转化。腐殖质还原菌在污染物原位 修领域有很好的应用前景，分离纯化新的腐殖质还原菌成为近年研究热点。微生物燃料电池(Microbial fuel cell，MFC)是以微生物为催化剂将有机物中的 化学能直接转化成电能的装置，具有产电与有机废弃物处置的双重功效。影响产电效率的 因素包括微生物代谢活性、阳/阴极材料等。其中，微生物产电能力是影响MFC输出功率密 度的最重要因素。近年研究发现，部分铁还原菌及腐殖质还原菌都具有高效产电活性，研究最多的 为希瓦氏菌属(Shewanella)与地杆菌属(Geobacter)。这些菌大都在中性条件下生长，且 多为革兰氏阴性菌。碱性条件有助于提高产电效率，但是碱性环境不利于大部分微生物生 长，因此本专利旨在开发碱性腐殖质还原及产电微生物。经文献和专利检索，尚未发现在碱 性条件下具有腐殖质还原及产电活性菌株的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是弥补现有技术的不足，提供一种碱性条件下生长的腐殖质还原及 产电高效菌株-腐殖质还原棒杆菌(Corynebacterium humireducens)。本专利技术的另一个目的是提供所述腐殖质还原棒杆菌的分离纯化方法。本专利技术的还有一个目的是提供所述腐殖质还原棒杆菌的应用。本专利技术筛选所得的腐殖质还原棒杆菌(Corynebacteriumhumireducens)，于2008 年4月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯 路中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 2452。所述腐殖质还原棒杆菌具有如下形态和生理生化特性1)菌体形态特性采用常规的细菌电子显微镜观察，该菌株为革兰氏阳性菌；扫描电子显微镜结果 显示菌株为棒状，菌体大小为0. 5 0. 7iimXl. 5 2. 5iim，不运动。2)菌落形态特性在牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基上好氧培养24小时后，菌落黄色，表面光滑，不 透明，边缘整齐，菌落直径为2 3mm。33)生理生化特征耐盐性强，能在0 12%氯化钠(NaCl)的培养液中生长；最适生长温度为37°C， 适宜生长的pH值为8 9。具兼性厌氧生长能力。接触酶阳性，化能异养菌，发酵代谢，不 产酸，不产气，能还原硝酸盐。在厌氧条件下，其电子供体利用谱较广，能以甲酸、乙酸、丙 酸、乳酸、乙醇或蔗糖为电子供体还原AQDS，不能利用柠檬酸或甘油。4)分子生物学特征采用SDS-蛋白酶K、氯仿-异戊醇(体积比24 1)抽提、0. 6体积异丙醇沉淀 的方法提取细菌总DNA。采用细菌16SrDNA通用引物F8和R1542扩增细菌的16SrDNA，在 1500bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输 入GenBank，以Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本专利技术菌株同 源性最近的6株菌都属于棒杆菌，但相似性均小于97%，界定为新种。本专利技术同时提供了所述腐殖质还原棒杆菌的分离纯化方法通过对本实验室微生 物燃料电池的碱性污泥阳极液进行分离纯化得到的。具体分离纯化方法包括以下步骤1)取微生物燃料电池的污泥阳极液接种于液体分离培养基中；液体分离培养基的组成是每升液体分离培养基中含1. 0g葡萄糖(电子供体)、 16gAQDS (电子受体)、2. 5g NaHC03、0.25g NH4C1、0. 678g NaH2P04.2H20、0. lg KCl、10.0mL维 生素溶液、10. OmL微量元素溶液，pH值为10。其中，维生素溶液是每升去离子水中含2. Omg 生物素、2. Omg叶酸、10. Omg维生素B6、5. Omg硫胺素、5. Omg核黄素、5. Omg烟酸、5. Omg泛酸 钙、0. lmg维生素B12、5. Omg对氨基苯甲酸、5. Omg硫辛酸；微量元素溶液是每升去离子水中 含 1. 5g 氨三乙酸、3. Og MgS04 7H20、0. 5g MnS04 H20、1. Og NaCl、0. lg FeS04 7H20、0. lg CoCl2 6H20、0. lg CaCl2、0. lg ZnS04 7H20、0. Olg CuS04 5H20、0. Olg A1K(S04)2 12H20、 0. Olg H3B03、0. Olg Na2Mo04 2H20。2)往已接种污泥微生物燃料电池的阳极液的液体分离培养基中鼓充高纯氮气不 少于30分钟，鼓气完毕盖橡胶盖加铝盖密封，置于厌氧工作站(N2和C02按照80 20的体 积比的混合)，30°C静置培养，观察培养液的颜色变化情况。3)当培养液颜色从无色变为深黄色时，以10%的接种量将培养液转接至另一新 鲜的液体分离培养基，厌氧操作及厌氧培养条件同(2)。如此富集培养三次。4)将第四代反应后的培养液采用稀释平板法稀释到105 106个/mL，将稀释后 的培养液0. lmL均勻涂布于LB固体培养基上，置于厌氧工作站(N2/C02 = 80/20) 30°C培养 48h，挑取单菌落进行分离与纯化。所述LB固体培养基的组成是蛋白胨10g/L酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L,琼脂粉 20g/L, pH 值为 10。本专利技术所述腐殖质还原棒杆菌在厌氧条件下的电子供体利用谱较广，能以甲酸、 乙酸、丙酸、乳酸、乙醇或蔗糖为电子供体还原AQDS，可广泛应用于有机污染物的原位生物修复。本专利技术所述腐殖质还原棒杆菌碱性条件下具有高效的腐殖质还原能力及产电活 性，其在碱性条件下产电稳定，燃料利用谱较广，能利用乳酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉、丁二酸、 麦芽糖或木糖等多种有机物，可用于微生物燃料电池发电技术及高浓度有机废弃物的资源 化处置。本专利技术的有益效果是本专利技术提供了一种新的在碱性条件下具有腐殖质还原及产电活性的棒杆菌菌株， 为碱性条件下腐殖质还原及微生物燃料电池发电技术提供了一种新的高效微生物菌株，应 用前景广阔。附图说明图1为本专利技术腐殖质还原棒杆菌CGMCC 2452在20000倍下的扫描电镜照片图2为腐殖质还原棒杆菌CGMCC 2452的系统发育树 图3为腐殖质还原棒杆菌CGMCC 2452在pH为9时还原AQDS的电子利用情况图4为腐殖质还原棒杆菌CGMCC 2452碱性条件下利用不同底物对应的产电活性具体实施例方式下面结合附图和具体实施例详细说明本专利技术。试验所用乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、乙 醇、蔗糖或葡萄糖等不一一在实施例中赘述。但并不因此限定本专利技术范围。实施例1 本专利技术腐殖质还原棒杆菌的分离纯化1)从pH为10的污泥微生物燃料电池中取5mL阳极液接种于IOOmL液体分离培养基中。所述污泥微生物燃料电池的构造在专本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腐殖质还原棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ），于２００８年４月１４日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　２４５２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周顺桂，武春媛，王跃强，李芳柏，袁勇，
申请(专利权)人：广东省生态环境与土壤研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]